【摘要】：第一部分EV71感染小鼠模型的建立及腦線粒體損傷的檢測(cè) 目的：建立EV71感染小鼠模型,檢測(cè)感染后不同時(shí)段腦線粒體損傷情況。 方法：1日齡ICR小鼠120只隨機(jī)分為2組,感染組(60只)每只小鼠腹腔內(nèi)注射含有EV71(TCID50=104)的DMEM培養(yǎng)基100μl,另60只為對(duì)照組,每只小鼠腹腔注射無(wú)菌DMEM培養(yǎng)基100μl。觀察小鼠感染后癥狀,并分別于病毒接種后1d、3d、5d、7d、10d、14d各用乙醚安樂(lè)死10只感染組小鼠與10只對(duì)照組小鼠取大腦。應(yīng)用熒光定量RT-PCR法檢測(cè)小鼠腦組織中EV71病毒載量,應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)小鼠腦細(xì)胞線粒體膜電位,應(yīng)用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)小鼠腦細(xì)胞胞漿中細(xì)胞色素C表達(dá),同時(shí)應(yīng)用光鏡及透射電鏡觀察腦組織病理及線粒體超微結(jié)構(gòu)變化。 結(jié)果：感染組小鼠于注射病毒3d候開(kāi)始出現(xiàn)弓背、少動(dòng)及后肢麻痹現(xiàn)象,感染5d時(shí)小鼠明顯消瘦。熒光定量RT-PCR結(jié)果顯示感染組3d及7d小鼠腦組織中EV71病毒載量明顯高于感染5d及10d小鼠(p0.01),對(duì)照組、感染組1d及14d小鼠腦組織無(wú)病毒核酸檢出。病理切片顯示感染組3d小鼠腦組織呈空泡樣改變,血管周圍出現(xiàn)大量炎癥細(xì)胞呈“套袖”樣浸潤(rùn),感染組5d小鼠腦組織內(nèi)有膠質(zhì)小結(jié)形成及噬神經(jīng)細(xì)胞現(xiàn)象。流式細(xì)胞結(jié)果顯示感染組3d及5d小鼠腦細(xì)胞線粒體膜電位顯著低于對(duì)照組(p0.01),而感染組1d、7d、10d、14d小鼠腦線粒體膜電位與對(duì)照組無(wú)顯著差異(p0.05)。免疫組化結(jié)果顯示感染組3d、5d、7d小鼠腦胞漿細(xì)胞色素C陽(yáng)性細(xì)胞比率明顯升高。電鏡結(jié)果顯示對(duì)照組小鼠腦細(xì)胞線粒體膜結(jié)構(gòu)完整,線粒體嵴清晰；感染組3d小鼠腦細(xì)胞線粒體略腫脹,線粒體嵴減少,感染組5天小鼠腦細(xì)胞線粒體嚴(yán)重腫脹,膜結(jié)構(gòu)破壞,線粒體嵴變短或消失,而感染10d時(shí)腦細(xì)胞線粒體線粒體結(jié)構(gòu)基本恢復(fù)正常。 結(jié)論：成功建立EV71感染小鼠模型,EV71感染小鼠后,小鼠腦組織出現(xiàn)嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)；EV71感染早期即出現(xiàn)腦細(xì)胞線粒體膜電位下降及線粒體超微結(jié)構(gòu)的改變,從而導(dǎo)致線粒體的損傷；EV71感染后期腦細(xì)胞線粒膜電位與線粒體超微結(jié)構(gòu)的改變呈恢復(fù)趨勢(shì)。 第二部分EV71感染小鼠腦線粒體損傷可能機(jī)制的研究 目的：探討EV71感染小鼠腦線粒體損傷可能的機(jī)制。 方法：在已建立的EV71感染小鼠模型基礎(chǔ)上,檢測(cè)病毒接種后1d、3d、5d、7d、10d、14d小鼠腦組織中炎癥細(xì)胞因子與氧化應(yīng)激因子的含量。應(yīng)用雙抗體兩步夾心酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測(cè)小鼠腦組織勻漿液中白細(xì)胞介素(Interleukin,IL)-6與IL-1β的濃度,比色法檢測(cè)腦組織中丙二醛(MDA)含量,硝酸還原法檢測(cè)腦組織中一氧化氮(NO)含量,同時(shí)分析它們與線粒體膜電位之間的相關(guān)性,從炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激兩個(gè)方面分析EV71感染小鼠后腦線粒體損傷的可能機(jī)制。 結(jié)果：感染組3d、5d與7d小鼠腦組織勻漿液中IL-1β濃度較正常對(duì)照組明顯升高(p0.01),且與腦線粒體膜電位呈負(fù)相關(guān),與腦組織MDA含量與NO濃度呈正相關(guān)；感染組3d、5d、7d與10d小鼠腦組織勻漿IL-6濃度較正常對(duì)照組明顯升高(p0.01),但與線粒體膜電位變化無(wú)明顯相關(guān)性；感染組3d、5d及7d小鼠腦組織腦組織MDA含量較正常對(duì)照組明顯升高(p0.01),感染組3d與5d小鼠腦組織NO濃度較正常對(duì)照組明顯升高(p0.01),且腦組織MDA含量及NO濃度與腦線粒體膜電位呈負(fù)相關(guān)。 結(jié)論：EV71感染過(guò)程中,IL-1β可能通過(guò)加重腦組織線粒體氧化應(yīng)激反應(yīng)而對(duì)線粒體功能產(chǎn)生損傷作用；氧化應(yīng)激是導(dǎo)致EV71感染小鼠腦組織線粒體損傷的機(jī)制之一,MDA和NO在氧化應(yīng)激導(dǎo)致EV71感染小鼠腦組織線粒體損傷中起到了重要作用。
【學(xué)位授予單位】：青島大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R373.2

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2781849