【摘要】： 研究目的：瘧疾尤其是惡性瘧目前仍然是世界上嚴(yán)重危害人類健 康的主要傳染病之一，研制有效的抗瘧疫苗具有重要的理論意義和實(shí)際 應(yīng)用價(jià)值。由于瘧原蟲復(fù)雜的生活史、繁多的抗原成分及強(qiáng)大的免疫逃 避能力，迄今在研究有效實(shí)用的瘧疾疫苗方面還沒有取得令人滿意的成 果。DNA疫苗技術(shù)的出現(xiàn)為疫苗的研制開辟了新的途徑。與傳統(tǒng)的蛋白 多肽類疫苗相比，DNA疫苗具有諸多優(yōu)點(diǎn)：它可在體內(nèi)持續(xù)表達(dá)與天然 抗原構(gòu)象相似的抗原蛋白；不但可誘導(dǎo)機(jī)體的體液免疫，產(chǎn)生抗原特異 性抗體，也可誘導(dǎo)機(jī)體的細(xì)胞免疫，產(chǎn)生細(xì)胞毒T細(xì)胞，而細(xì)胞免疫對 于抵御像瘧原蟲這樣的胞內(nèi)寄生蟲感染十分重要。 本實(shí)驗(yàn)室利用基因工程重組技術(shù)，合成了一個(gè)編碼惡性瘧原蟲不同 發(fā)育階段抗原表位的保護(hù)性抗原復(fù)合基因HGFSP，此基因表達(dá)的重組蛋 白疫苗及含HGFSP基因的重組痘苗活疫苗可誘導(dǎo)HGFSP特異性抗體生 成，免疫血清可抑制體外培養(yǎng)的紅內(nèi)期惡性瘧原蟲的生長。本研究利用 HGFSP與真核表達(dá)載體pcDNA3重組，構(gòu)建重組真核表達(dá)質(zhì)粒 pc-HGFSP；脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染肝癌HepG2細(xì)胞，觀察HGFSP基因體外表 達(dá)產(chǎn)物的抗原性；pc-HGFSP質(zhì)粒DNA直接免疫小鼠，觀察其在小鼠肌 肉組織的表達(dá)及所誘導(dǎo)的體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答；觀察pc-HGFSP免疫血 清對體外生長紅內(nèi)期惡性瘧原蟲的抑制作用。通過探索瘧原蟲DNA免疫 新途徑，為結(jié)合應(yīng)用HGFSP的重組蛋臼疫茵、DNA疫茵和重組痘苗病 毒疫苗進(jìn)行抗攻擊試驗(yàn)奠定基礎(chǔ)。 研究方法：一．重組真核表達(dá)質(zhì)粒 P C十GFSP的構(gòu)建及鑒定 1．亞 克隆法構(gòu)建重組真核表達(dá)質(zhì)粒 p C爿GFSP；并用酶切鑒定。L脂質(zhì)體 介導(dǎo)法轉(zhuǎn)染肝癌 HCpGZ紉1胞；G4選樣堵養(yǎng)陽性細(xì)胞克隆后用問接免 疫熒光試驗(yàn)門）觀察 HGFSP抗原的表達(dá)；SDS。PAGE及 Western blot 鑒定表達(dá)產(chǎn)物的抗原性。二．pc十GFSP質(zhì)粒DNA免疫小鼠誘導(dǎo)的免疫應(yīng) 答1．堿裂解法大量制備pCKGFSP重組質(zhì)粒及pCDNA3載體質(zhì)粒。 2．C57BL歷小鼠隨機(jī)分為：①NS對照；②pCDNA3 ＆體質(zhì)粒對照；③ pcKGFSP重組質(zhì)粒組。鹽酸hi比卡因匕 0 u g／ml于左后肢股四頭肌注射 預(yù)處理 24h后，于同一部位注射 ling／nl DNA溶液 0、lml，對照組注射等 體積 NS或載體質(zhì)粒，間隔 3周（dZI，d42）各同量加強(qiáng)免疫一次，于末 次加強(qiáng)免疫后 2周（d56）和 4周（d70）取小鼠血清及脾細(xì)胞觀察多項(xiàng) 免疫學(xué)指標(biāo)。3．ELIS＾法測定血清抗 IIGFSP－IgG含量：每組 6 ．q眼眶或 割尾取血，1：100稀釋后加入經(jīng) HGFSP抗原包被的 96孔板進(jìn)行測定。 4．淋巴細(xì)胞增殖活性測定：d56、d70取＊5 XIO懺L脾細(xì)胞懸液于 96孔 板，每個(gè)樣本分4組：①培養(yǎng)液空白對照；②pc－HGFSP實(shí)驗(yàn)組；＠ConA 陽性對照；④轉(zhuǎn)鐵蛋白陰性對照，用MTT ＆測定并計(jì)算刺激指數(shù)SI。 5．NK細(xì)胞活性測定：實(shí)驗(yàn)設(shè)靶綱胞自發(fā)釋放孔、靶細(xì)胞最大釋放孔、一 脾細(xì)胞自發(fā)釋放孔及實(shí)驗(yàn)孔（效應(yīng)細(xì)胞＋靶細(xì)胞）。脾效應(yīng)細(xì)胞（E）：YACd （T）。25：l及50：l，以 YAC－l為靶細(xì)胞用 LDH＆測定并計(jì)算NK細(xì) 胞活性。6．CTL活性測定：于 d56取腳細(xì)胞懸液于 24孔板，加 Con A、 rhIL．2和 HGFSP蛋白抗原培養(yǎng) 5天誘生CTLs，用 HGFSP蛋白抗原處理 的 PSIS靶細(xì)胞按 NK活性測定方法測定并計(jì)算 CTL活性。7．CD4”、 CDS”T細(xì)胞亞群測定：d56、d70取脾細(xì)胞按試劑盒的方法用抗CD4及 抗CDS單抗進(jìn)行，當(dāng)日用流式細(xì)胞儀測定。8．血清一氧化氮（NO）含 2 量測定：d56，d70 t小鼠血清按NO試劑盒的方法進(jìn)行。9．注射部位肌 肉組織免疫酶檢查：取小鼠注射部位肌肉組織，固定、包埋。切片后進(jìn) 行。10．脾臟指數(shù)測定：處死動(dòng)物時(shí)稱取小鼠脾臟重量，計(jì)算其占體重 的百分比。11．體外抑制試驗(yàn)；蠟燭缸法培養(yǎng)惡性瘧原蟲，5％山梨醇同 步化處理，加不同濃度pC－HGFSP免疫組小鼠血清，以同濃度pCDNA3 載體質(zhì)粒兔疫組血請為陰性對照，于第24h及72h分取血樣涂片染色鏡 檢，計(jì)算原蟲抑制率。 結(jié)果；一，重組真核表達(dá)質(zhì)粒P。－HGFSP的構(gòu)建及鑒定1．酶切 電泳結(jié)果顯示，pc－HGFSP可用 Hindlll和 BamHI yRta切切出約 600hp長 的 HGFSP完整基因片段，用 PSt單酶切，可切出約 350hp長的部分基 因片段，說明pc－HGFSP構(gòu)建正確。2．IFA結(jié)果顯示，pC－HGFSP／HepGZ 細(xì)胞產(chǎn)生較強(qiáng)的免疫熒光反應(yīng)，而未經(jīng)轉(zhuǎn)染的HepGZ細(xì)胞無熒光反應(yīng)。 3．SDS－PAGE及 WestsrS blot結(jié)果顯示，PC－HGFSP／fICpGZ細(xì)胞裂解液 中出現(xiàn)一條分子量約23kDa的蛋臼條帶，司”特異性為HGFSP蛋白抗原免 疫血清識別。二．P。－HGFSP質(zhì)粒DNA兔疫小鼠誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答：1．免 疫后三次（d56、d70、d84）ELISA法測定，pC－HGFSP u疫小鼠血清 HGFSP抗原
【學(xué)位授予單位】：第一軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2000
【分類號】：R382.31

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2767964