【摘要】：目的：探索滑膜間充質(zhì)干細(xì)胞(SMSCs)穩(wěn)定地向纖維軟骨分化的充分必要條件,并在體外實(shí)驗(yàn)中重復(fù)這一過(guò)程；進(jìn)而初步探索這一過(guò)程調(diào)控的分子機(jī)制。方法：通過(guò)貼壁法和有限稀釋技術(shù)得到SMSCs,通過(guò)形態(tài)學(xué)、超微結(jié)構(gòu)、分子表型、細(xì)胞代謝動(dòng)力學(xué)、多向誘導(dǎo)分化等方法鑒定SMSCs并驗(yàn)證其穩(wěn)定性、安全性、成軟骨能力、細(xì)胞活性和三向分化潛能等生物學(xué)特征。通過(guò)綜述文獻(xiàn)、模擬體內(nèi)環(huán)境等方法,經(jīng)過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)篩選后,使用L60(212)正交試驗(yàn)探索SMSCs向纖維軟骨分化的充分必要條件；正交試驗(yàn)以纖維軟骨生成率為因變量,使用RT-PCR方法檢測(cè)纖維軟骨細(xì)胞的基因表達(dá),使用甲苯胺藍(lán)等特異染色手段檢測(cè)軟骨特異性分子的表達(dá),以計(jì)算軟骨生成率。通過(guò)反復(fù)試驗(yàn)和比對(duì)探索出SMSCs向纖維軟骨分化并穩(wěn)定表達(dá)的最佳條件后,使用基因芯片的方法檢測(cè)這一過(guò)程差異表達(dá)的基因�；蛐酒�8697個(gè)目的基因來(lái)源于文獻(xiàn)綜述,2153個(gè)基因序列來(lái)源于expressed sequence-tag (EST) library,6,544是根據(jù)NCBI database Genebank數(shù)據(jù)庫(kù)證實(shí)的基因構(gòu)建,一些基因的開(kāi)放性閱讀框太短,無(wú)法用于基因芯片,最終用于基因芯片檢測(cè)的基因有8605個(gè)。差異表達(dá)的基因再使用半定量RT-PCR的方法進(jìn)一步驗(yàn)證。使用Quackenbush的方法進(jìn)行數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化和背景噪音的消除,使用Eisen的方法進(jìn)行基因芯片數(shù)據(jù)分析,2倍表達(dá)差異作為差異表達(dá)的下限。此后進(jìn)行基因功能分析。最后,針對(duì)基因芯片的表達(dá)結(jié)果和實(shí)驗(yàn)中涉及的調(diào)控條件推論TGF β-TGF β receptor-Smad2/3通路和BMP-BMP receptor-Smad1/5/8通路參與SMSCs成纖維軟骨過(guò)程中的調(diào)控,使用RT-PCR和Western-Blotting的方法在基因水平和蛋白水平證實(shí)纖維軟骨基因和調(diào)控因子間的關(guān)系,使用軟骨特異性染色和特異分子的染色鑒定這些分子在SMSCs誘導(dǎo)分化后的高表達(dá)。結(jié)果：SMSCs具有穩(wěn)定、安全、成軟骨能力強(qiáng)、細(xì)胞活性好、取材方便等特征。在SMSCs成纖維軟骨過(guò)程中TGF β1,BMP7, ASA, bFGF, IGF是最重要的調(diào)控因子,通過(guò)對(duì)這些因子的劑量和時(shí)序表達(dá)的改變,可以顯著的影響SMSCs成纖維軟骨的過(guò)程。其他細(xì)胞因子與前述因子存在交互,調(diào)控顯著性不及前述因子。除細(xì)胞因子外,機(jī)械環(huán)境氧濃度等亦是重要的調(diào)控作用,通過(guò)合理配置這些調(diào)控作用,能夠得到穩(wěn)定的纖維軟骨轉(zhuǎn)化率。基因芯片證實(shí),SMSCs成軟骨過(guò)程中,目標(biāo)基因中1361基因差異表達(dá),這些基因并不是持續(xù)高表達(dá),而是隨時(shí)間變化不斷調(diào)整表達(dá)豐度。聚類(lèi)分析顯示,分化第21天的細(xì)胞與原始SMSCs的基因相似程度較高,而分化3、7、14天的細(xì)胞更加相似。主要功能基因的分析顯示無(wú)論是SMSCs原代細(xì)胞還是成纖維軟骨誘導(dǎo)后的細(xì)胞其增殖相關(guān)基因表達(dá)增高顯著,大部分的高表達(dá)基因在這一過(guò)程中的作用還不是非常清楚。TGF β-TGF β receptor-Smad2/3通路和BMP-BMP receptor-Smad1/5/8通路是兩條重要的調(diào)控通路,糖濃度和機(jī)械環(huán)境對(duì)SMSCs成纖維軟骨的調(diào)控通過(guò)前述通路實(shí)現(xiàn)。許多調(diào)控通路中涉及大量未知的調(diào)控因子和旁路,即使是已知的通路中仍存在未知的作用。結(jié)論：SMSCs是理想的半月板組織工程種子細(xì)胞來(lái)源;合理的培養(yǎng)條件能得到SMSCs穩(wěn)定向纖維軟骨細(xì)胞分化的支架模型；這一過(guò)程涉及存在大量差異表達(dá)的基因且多數(shù)功能不清楚值得深入探索；TGF β-TGF β receptor-Smad2/3通路和BMP-BMP receptor-Smad1/5/8通路是兩條重要的基因調(diào)控通路,糖濃度和機(jī)械環(huán)境對(duì)SMSCs成纖維軟骨的調(diào)控通過(guò)前述通路實(shí)現(xiàn)；調(diào)控通路和基因表達(dá)之間關(guān)系復(fù)雜,即有調(diào)控通路下游基因的差異表達(dá),又存在調(diào)控通路本身基因的差異表達(dá),還有已表達(dá)的基因在小干擾RNA作用下降解等問(wèn)題,深入研究SMSCs成軟骨過(guò)程的分子機(jī)制對(duì)體外構(gòu)建有生物學(xué)功能的半月板組織至關(guān)重要。
【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類(lèi)號(hào)】：R329.2

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2754011