脫氧雪腐鐮刀菌烯醇對機體免疫功能影響的實驗研究

發(fā)布時間：2020-07-10 06:58

【摘要】： 目的：單端孢霉烯族毒素是一組結構相似的真菌次級代謝產物，具有明顯的毒性效應。脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(deoxynivalenol, DON)又名嘔吐毒素(vomitoxin VT)，是其中最常見的一種，其結構為3α,7α,15-三羥基-12,13-環(huán)氧單端孢霉-9烯-8酮，為雪腐鐮刀菌烯醇的脫氧衍生物，主要由某些鐮刀菌產生。在全世界范圍內，糧食及其制品DON污染谷類的情況均非常普遍。研究表明，在我國食管癌高發(fā)區(qū)居民飲食中DON也是主要污染霉菌毒素之一。動物實驗結果提示，DON可抑制生物大分子的合成，也可對免疫系統(tǒng)發(fā)揮一定的影響。目前有關DON對免疫功能影響的研究尚存在一些問題，即DON對免疫功能的影響多是在體外進行的，主要集中在淋巴細胞因子分泌方面，而且有關消除DON對免疫系統(tǒng)影響的研究甚少。機體的免疫系統(tǒng)是一個非常復雜的生物學系統(tǒng)，包括補體系統(tǒng)、細胞因子分泌、黏附分子系統(tǒng)、免疫細胞的凋亡與增殖以及抗原加工遞呈等諸多方面。故進一步了解DON對免疫細胞的凋亡與增殖以及抗原加工遞呈的影響和如何消除或降低DON對免疫系統(tǒng)的負面作用是非常必要的。本研究探討了DON體內對小鼠胸腺細胞凋亡和增殖的影響并初步探討了維生素C和核黃素體內對DON誘發(fā)小鼠胸腺細胞凋亡和增殖抑制的阻斷作用；同時探討了DON對體外培養(yǎng)的人外周血單個核細胞表面人白細胞抗原Ⅰ類分子（human leucocyte antigenⅠ,HLA-Ⅰ）以及抗原處理相關轉運體－１（transporter associated with antigen processing, TAP-1）和低分子量蛋白多肽－２(low molecular weight polypeptides, LMP-2)表達的影響。旨在全面了解DON對機體免疫系統(tǒng)的影響，以期進一步分析DON的生物效應，揭示飲食DON暴露對機體的可能影響及其在我國食管癌高發(fā)區(qū)腫瘤發(fā)生發(fā)展中的可能作用。方法：１　脫氧雪腐鐮刀菌烯醇對小鼠胸腺細胞凋亡和增殖影響的檢測分析 WP=5 昆明小鼠48只隨機分為對照組和實驗組，實驗組根據DON處理濃度又分為DON 0.5mg/kg、DON 1mg/kg、DON 2mg/kg、DON 4mg/kg和DON 8mg/kg組，共6組，每組８只實驗動物。實驗組和對照組動物分別腹腔注射0.2mL不同濃度的DON溶液和生理鹽水。于注射后12 h，股動脈放血處死動物，取出胸腺組織，應用電鏡觀察、DNA瓊脂糖凝膠電泳和流式細胞定量檢測技術（FCM）檢測不同濃度DON處理胸腺細胞凋亡和增殖情況。２　核黃素和維生素C預處理對DON誘導小鼠胸腺細胞凋亡和增殖抑制的影響。　　昆明小鼠112只，隨機分為對照組、DON （4mg/kg）組、核黃素（1.25mg/kg和10mg/kg）組、抗壞血酸(25mg/kg和100mg/kg)組、不同劑量核黃素（1.25mg/kg,2.5mg/kg,5.0mg/kg,和10.0mg/kg）預處理+ DON（4mg/kg）組和不同劑量抗壞血酸（25mg/kg,50mg/kg,75mg/kg,和100mg/kg）預處理+DON（4mg/kg）組，共14組，每組８只實驗動物。核黃素、抗壞血酸組及預處理組分別按分組劑量灌喂核黃素和抗壞血酸，每日1次，每次0.5mL/只，連續(xù)5d；對照組和DON（4mg/kg）組灌喂等體積的生理鹽水。于最后1次灌喂后12h，對照組、核黃素（1.25mg/kg和10mg/kg）組和抗壞血酸(25mg/kg和100mg/kg)組分別腹腔注射生理鹽水0.2mL/只，其余各組實驗動物分別腹腔注射DON溶液（4mg/kg.BW, 0.2mL /只）。12 h后，股動脈放血處死動物，取出胸腺組織，應用DNA瓊脂糖凝膠電泳和流式細胞術檢測方法進行凋亡和增殖的檢測。３　體外培養(yǎng)的人外周血單個核細胞表面HLA－Ⅰ抗原檢測健康獻血員抗凝靜脈血200mL，采用聚蔗糖-泛影葡胺密度梯度離心法(ficoll-hypaque density gradient centrifugation）分離人外周靜脈血單個核細胞，接種于含10%胎牛血清，105U/L青霉素，100mg/L鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基中，加入PHA至終濃度300μg/mL，37℃，5%CO2培養(yǎng)48h，更換不含PHA的新的培養(yǎng)基。隨機分為實驗組和對照組，實驗組加入DON至終濃度分別為50ng/mL，100ng/mL，1000ng/mL和2000ng/mL，對照組加等體積的生理鹽水。處理24h，更換不含DON的新的RPMI WP=6 1640培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24h，然后離心收集細胞。采用流式細胞定量檢測技術（FCM）和蛋白印跡（Western Blotting）檢測HLA-Ⅰ分子的表達情況。４　體外培養(yǎng)的人外周血單個核細胞TAP-1和LMP-2的mRNA及其蛋白表達的檢測　　人外周靜脈血單個核細胞的分離培養(yǎng)和處理方法同前，離心收集細胞提取總RNA，應用反轉錄－聚合酶連反應（RT-PCR）方法檢測體外培養(yǎng)的人外周靜脈血單個核細胞（HPBMc）抗原處理相關轉運體－１（TAP-1）和低分子量蛋白－２（LMP-2）mRNA的表達情況；應用流式細胞定量檢測技術（FCM）檢測TAP-1和LMP-2蛋白的表達情況。結果：１　脫氧雪腐鐮刀菌烯醇體內對小鼠胸腺細胞凋亡和增殖的影響 FCM DNA直方圖表明，不同濃度DON處理12h后，小鼠胸腺細胞DNA直方圖二倍體峰前均可見凋亡細胞特征性的亞二倍體峰。FCM定量檢測結果表明，不同濃度DON處理后，各組小鼠胸腺細胞的平均凋亡百分率都明顯高于生理鹽水對照組（P0.01），而且隨著DON濃度的升高，凋亡百分率也相應升高，在0.5mg/kg到8mg/kg的濃度范圍內，兩者呈明顯的正相關，直線回歸方程為Y=5.75+0.98X ( r=0.788, P0.01, n=8)。透射電
【學位授予單位】：河北醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2003
【分類號】：R392
【圖文】：

核黃素,抗壞血酸,增殖抑制,外周血單個核細胞