【摘要】：骨是成年人體中少數(shù)幾個仍保持再生潛能的器官之一，是唯一一個生命中能保持不斷重塑的器官。骨有兩種形成方式即膜內(nèi)成骨和軟骨內(nèi)成骨。骨再生與軟骨內(nèi)成骨相似，主要始于間充質(zhì)干細(xì)胞的趨化和增殖。有效的骨再生在臨床上許多骨或肌肉骨骼系統(tǒng)疾病中發(fā)揮著非常重要的作用，如部分骨缺損、骨折不愈合，骨質(zhì)疏松性骨折，失敗的脊椎融合術(shù)等。因此，探究闡明骨形成的分子機制對于了解骨疾病的發(fā)病機理至關(guān)重要。 在胚胎成骨以及成人骨修復(fù)和骨轉(zhuǎn)換中涉及到一類被廣泛應(yīng)用的細(xì)胞—間充質(zhì)干細(xì)胞（Mesenchymal Stem Cells，MSCs），傳統(tǒng)認(rèn)為MSCs主要存在于骨髓，但是后期研究發(fā)現(xiàn)MSCs也可以存在其他組織器官。MSCs具有多向分化潛能，能分別向成骨、成脂、成軟骨、成纖維等細(xì)胞系分化。有許多研究顯示有許多不同的信號通路在調(diào)控干細(xì)胞自我更新及世系提交等方面發(fā)揮著重要的作用，但是在骨再生研究中調(diào)控間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨方向分化的機制是需要關(guān)注且探討的關(guān)鍵性問題。 骨形態(tài)發(fā)生蛋白（Bone Morphorgenetic Proteins，BMPs）對于發(fā)育過程中的細(xì)胞增殖和分化都發(fā)揮著重要的作用，可以調(diào)控間充質(zhì)干細(xì)胞向骨、軟骨、脂肪和肌腱等方向分化，是研究比較早，也是最具有潛力的一類誘導(dǎo)MSCs成骨分化的細(xì)胞因子。BMPs屬于TGF-β超家族成員，目前已知有20余種BMPs。本實驗室前期對BMP2-BMP15共14種BMPs進行了系統(tǒng)分析，發(fā)現(xiàn)BMP9是誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞在體內(nèi)和體外成骨分化能力最強的BMPs成員。 BMP9（也稱為生長分化因子2, GDF-2）最初是從生長發(fā)育的小鼠肝臟中分離得到的，它的作用包括：誘導(dǎo)和維持前腦膽堿能神經(jīng)元的表型，抑制肝臟葡萄糖產(chǎn)生，誘導(dǎo)脂代謝關(guān)鍵酶表達及刺激小鼠鐵調(diào)素1的表達。BMP9誘導(dǎo)成骨的活性具有潛在的臨床應(yīng)用價值，也越來越受到關(guān)注，但是BMP9在誘導(dǎo)干細(xì)胞成骨過程中的調(diào)節(jié)機制卻不甚明了。許多其他生長因子可能與BMP9誘導(dǎo)成骨存在協(xié)同或拮抗作用，本實驗室也已經(jīng)進一步證實了BMP9調(diào)節(jié)著一系列特異的下游靶通路，這些通路的因子都在BMP9誘導(dǎo)的間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化過程中發(fā)揮著重要作用。 本實驗研究的目的是：探究（1）Notch信號通路是否與BMP9在誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化中存在著必然的聯(lián)系；（2）Notch信號通路在BMP9誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化中發(fā)揮著關(guān)鍵且不可缺的作用；（3）BMP9調(diào)控Notch信號通路誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的可能機制。 在本研究的第一部分：首先，使用Notch信號傳導(dǎo)通路中的關(guān)鍵酶γ-分泌酶的抑制劑Compound E抑制了γ-分泌酶的活性，通過檢測早期成骨指標(biāo)堿性磷酸酶（ALP）活性，研究其對BMP9誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化作用的影響，結(jié)果表明：抑制γ-分泌酶的活性可以降低BMP9誘導(dǎo)iMEFs細(xì)胞的早期成骨作用。隨后，通過茜素紅S染色分析成骨晚期指標(biāo)鈣鹽沉積的情況，結(jié)果顯示抑制γ-分泌酶的活性可以降低BMP9誘導(dǎo)的iMEFs細(xì)胞的晚期成骨作用。此部分初步證實，Notch信號通路在BMP9誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化中發(fā)揮著重要的作用，為后續(xù)研究奠定基礎(chǔ)。 接下來，提取iMEFs總RNA，通過RT-PCR檢測Notch受體和配體的內(nèi)源性表達情況，結(jié)果表明Notch1表達最多，而Notch4，DLL3及DLL4則看不到表達。因此，我們想看看表達最多的Notch1對BMP9誘導(dǎo)iMEFs細(xì)胞成骨分化的影響，提取顯性負(fù)性Notch1（dnNotch1）腺病毒感染過的iMEFs的總RNA，進行RT-PCR證實dnNotch1的競爭性抑制作用，為接下來的體內(nèi)和體外實驗保證抑制Notch1活性奠定基礎(chǔ)。體外實驗，通過ALP定性和定量實驗，免疫細(xì)胞化學(xué)檢測OPN和OCN表達以及茜素紅S染色實驗結(jié)果表明，dnNotch1可以抑制BMP9誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞早期成骨指標(biāo)ALP的活性，抑制晚期成骨指標(biāo)OPN和OCN的表達以及抑制鈣鹽沉積，并且其抑制作用存在劑量依賴性。體內(nèi)實驗，將腺病毒dnNotch1和BMP9共同感染iMEFs，在裸鼠皮下進行注射，檢測dnNotch1競爭性抑制Notch1后，對BMP9誘導(dǎo)的間充質(zhì)干細(xì)胞的體內(nèi)成骨作用的影響，結(jié)果表明：（1）細(xì)胞接種4周后，各組都形成了堅硬的包塊，表明各組均有骨組織形成。（2）Micro-CT掃描和影像重建結(jié)果顯示抑制Notch1作用可降低形成的骨包塊的體積。（3）石蠟包埋、切片進行HE染色，結(jié)果顯示dnNotch1能夠抑制骨小梁數(shù)量及形成質(zhì)量。（4）Alcian Blue染色結(jié)果顯示dnNotch1能導(dǎo)致不成熟的軟骨基質(zhì)形成。（5）Masson’s Trichrome染色結(jié)果顯示dnNotch1導(dǎo)致藍綠色的骨基質(zhì)明顯減少，骨組織成熟度降低�？傊�，抑制Notch1的活性，能夠降低BMP9誘導(dǎo)的間充質(zhì)干細(xì)胞體內(nèi)成骨分化的數(shù)量以及成熟質(zhì)量，這與之前的體外實驗結(jié)果亦相吻合。 通過前面兩個方面的研究，可知道Notch與BMP9在誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化方面存在著密切的聯(lián)系。然后，又引入使用兩個配體Jagged1和DLL1過表達腺病毒，通過提取腺病毒Jagged1或DLL1感染過的iMEFs細(xì)胞的總RNA，進行RT-PCR驗證Jagged1及DLL1過表達的效果，為后續(xù)實驗打基礎(chǔ)。在體外實驗中，用Jagged1或DLL1與BMP9聯(lián)合感染iMEFs后，通過ALP定性和定量實驗檢測早期成骨指標(biāo)ALP活性，免疫細(xì)胞化學(xué)檢測成骨晚期指標(biāo)OPN和OCN表達以及茜素紅S染色檢測晚期成骨指標(biāo)鈣鹽沉積，結(jié)果顯示DLL1能夠在體外增強BMP9誘導(dǎo)iMEFs成骨分化的作用，Jagged1能在體外增強BMP9誘導(dǎo)的ALP活性，鈣鹽沉積及OPN的表達。體內(nèi)實驗，將Jagged1或DLL1和BMP9共感染iMEFs細(xì)胞，對裸鼠進行皮下注射，4周后觀察并獲取皮下包塊，Micro-CT掃描和影像重建，石蠟包埋，切片，進行組織化學(xué)染色（HE染色，Alcian Blue染色和Masson’s Trichrome染色），結(jié)果顯示， DLL1能增加BMP9誘導(dǎo)的iMEFs成骨分化活躍程度，與體內(nèi)實驗結(jié)果相一致，而Jagged1則能增加軟骨形成，降低骨成熟度�？傊�， DLL1過表達能夠增強BMP9誘導(dǎo)的間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化，而Jagged1則降低骨成熟度。 進一步，想最終確認(rèn)Notch信號通路與BMP9的密切聯(lián)系，引入使用兩個特殊的小鼠成纖維干細(xì)胞株DKO-PS1：PS1（γ-分泌酶關(guān)鍵成分）及PS2雙敲除后，外源性植入PS1進行補救，相當(dāng)于正常細(xì)胞株；DKO-EV：PS1及PS2雙敲除后，外源性植入空載體，做對照，想檢測當(dāng)PS1敲除后，Notch信號傳導(dǎo)受阻礙對BMP9誘導(dǎo)的間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的影響。首先，采用Western Blot檢測PS1及nacastin的表達情況，證實PS1確實補救成功。緊接著，通過體外實驗檢測，BMP9誘導(dǎo)的間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的早期指標(biāo)ALP的活性及晚期指標(biāo)OPN和OCN的表達情況及晚期指標(biāo)鈣鹽沉積情況，結(jié)果顯示PS1敲除相比PS1補救的iMEFs，BMP9誘導(dǎo)成骨分化的作用明顯降低。體內(nèi)實驗結(jié)果顯示，PS1敲除后BMP9誘導(dǎo)的骨形成包塊體積明顯減小，骨小梁數(shù)量及形成質(zhì)量明顯降低，骨包塊的成熟程度及骨形成過程的活躍度度亦明顯降低�？傊�，此部分結(jié)果表明PS1作為Notch關(guān)鍵酶γ-分泌酶的關(guān)鍵成分在BMP9誘導(dǎo)的iMEFs成骨分化中發(fā)揮著關(guān)鍵而不可缺的作用，進一步說明Notch信號通路在BMP9誘導(dǎo)成骨分化中的關(guān)鍵作用。 通過第一部分的結(jié)果，初步了解到：（1）抑制γ-分泌酶的活性能降低BMP9誘導(dǎo)的iMEFs在體內(nèi)及體外的成骨作用；（2）dnNotch1競爭與配體結(jié)合從而抑制Notch1活性亦能在體內(nèi)及體外降低BMP9誘導(dǎo)iMEFs的成骨作用；（3）過表達配體DLL1能增加體內(nèi)及體外BMP9誘導(dǎo)的成骨作用，Jagged1能增加體外BMP9誘導(dǎo)成骨作用，而在體內(nèi)增加軟骨形成，降低骨成熟度；（4）敲除γ-分泌酶關(guān)鍵成分PS1干擾Notch信號傳導(dǎo)能明顯降低BMP9誘導(dǎo)的iMEFs在體內(nèi)及體外的成骨作用�？傊�，可以認(rèn)識到Notch信號通路在BMP9誘導(dǎo)的成骨分化中發(fā)揮著重要不可缺的作用，Notch信號通路是BMP9發(fā)揮作用的重要的下游靶通路。因此，在第二部分將初步探討B(tài)MP9調(diào)控Notch信號通路的機制：（1）dnNotch1競爭與配體結(jié)合抑制Notch1活性，Jagged1或DLL1過表達，敲除γ-分泌酶關(guān)鍵成分PS1，對BMP9誘導(dǎo)iMEFs成骨分化早期細(xì)胞增殖及細(xì)胞周期的影響；（2）BMP9促進iMEFs成骨分化過程Notch胞內(nèi)段NICD及Notch1在細(xì)胞內(nèi)表達情況；（3）iMEFs細(xì)胞中BMP9誘導(dǎo)iMEFs成骨分化過程中Notch家族受體及配體基因表達情況及PS1敲除后BMP9作用下Runx2、OPN、OCN、Hey1、Id1和CTGF表達變化。 首先，流式細(xì)胞術(shù)檢測，作用24h后，dnNotch1能明顯降低BMP9促進iMEFs增殖的作用，即G2期及G2+S期明顯降低；Jagged1或DLL1則能明顯增加BMP9的作用，即G2期及G2+S期明顯增高；DKO-PS1相比DKO-EV的G2期及S期+G2期同樣明顯升高。這部分表明，BMP9在誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化早期具有促進細(xì)胞增殖的作用而Notch信號通路在BMP9促進細(xì)胞增殖中發(fā)揮著必不可少的作用。 其次，免疫細(xì)胞熒光化學(xué)檢測，作用24h后，BMP9能明顯增加iMEFs細(xì)胞中Notch胞內(nèi)段NICD的表達，并且主要定位于細(xì)胞核內(nèi)，同樣BMP9也能增加細(xì)胞中Notch1的表達。 然后，通過RT-PCR檢測BMP9作用下，Notch受體和配體mRNA在iMEFs細(xì)胞中的表達情況，從結(jié)果看，不同的Notch成員呈現(xiàn)不同的表達趨勢。從第1-3天，不同的Notch成員表達變化完全不同。在第1天BMP9明顯促進Notch1、Notch2及DLL4的表達，而對Jagged2及DLL1有輕度抑制表達作用，BMP9促進表達的Notch成員多于抑制表達的成員。接著，將PS1敲除后，BMP9作用下，第3天及第5天Runx2、OCN、OPN和Id1明顯降低，Id1在PS1補救后第5天比第3天表達降低；第2天， BMP9作用下DKO-PS1的Hey1及CTGF都明顯高于DKO-EV。 通過第二部分結(jié)果，得知：（1）BMP9在誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞早期能夠促進細(xì)胞的增殖，在抑制Notch1活性及敲除PS1后，BMP9促進細(xì)胞增殖的作用也隨之下降，Jagged1及DLL1則能增加這種促進作用。這可能與Notch參與了BMP9早期促進間充質(zhì)干細(xì)胞增殖的作用相關(guān)。（2）BMP9能夠增加Notch胞內(nèi)段NICD的表達，并且促進其轉(zhuǎn)移到核內(nèi)，同時也能增加Notch1的表達，可能由于BMP9促進Notch1等Notch成員的表達，從而激活信號傳導(dǎo)，NICD表達增多并解離，繼而進入細(xì)胞核內(nèi)促進下游靶基因的轉(zhuǎn)錄表達。（3）BMP9作用下，Notch家族成員表達均發(fā)生不同變化，第1天BMP9促進表達的Notch成員多于抑制表達的成員，尤其Notch1表達明顯增高。PS1缺失情況下，Runx2、OPN、OCN、Hey1、Id1和CTGF表達均降低，說明BMP9可以調(diào)控Notch表達發(fā)生變化，而BMP9調(diào)控靶基因作用又需要有Notch參與。 綜上所述，抑制Notch信號通路能抑制BMP9誘導(dǎo)的間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化中；抑制Notch1活性能抑制BMP9誘導(dǎo)的間充質(zhì)干細(xì)胞增殖和成骨分化中；DLL1增加BMP9誘導(dǎo)的間充質(zhì)干細(xì)胞增殖和成骨分化，Jagged1能增加BMP9誘導(dǎo)的間充質(zhì)干細(xì)胞增殖和體外成骨分化；BMP9作用下，Notch受體和配體均發(fā)生不同的表達變化，可能是BMP9通過早期作用于Notch1或其它成員導(dǎo)致其表達發(fā)生變化，從而激活Notch如Notch1-DLL1信號傳導(dǎo)通路，而增加Notch1胞內(nèi)段NICD的表達，促進下游靶基因的轉(zhuǎn)錄表達，從而參與對細(xì)胞增殖的調(diào)控，進而促進成骨分化。
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R329.2
【圖文】：

采用 ALP 活性定量及染色的方法檢測早期成骨指標(biāo) ALP 的變化。結(jié)果表明，不同濃度的 CE 作用均能降低 BMP9 誘導(dǎo)的 iMEFs 細(xì)胞的 ALP 活性，劑量依賴性不明顯（圖 1-1A）。第 5 天（Day 5）ALP 染色也顯示 CE 能降低 BMP9 誘導(dǎo)的 ALP 染色，與活性定量結(jié)果一致（圖 1-1B）。

圖 1-2 γ-分泌酶抑制劑 CE 抑制 BMP9 誘導(dǎo) iMEFs 晚期鈣鹽沉積（100×）Figure1-2 γ-secretase inhibitor CE depressed BMP9-induced calcium precipitation of iMEFs（100×）2.2 間充質(zhì)干細(xì)胞 iMEFs 內(nèi)源性 Notch 受體及配體基因表達情況提取 iMEFs 細(xì)胞總 RNA，通過 RT-PCR 檢測 iMEFs 細(xì)胞內(nèi)源性 Notch 受體（Notch1-Notch4）及配體（Jagged1，2，DLL1，3，4）表達情況。結(jié)果顯示，Notch家族各成員表達非常不一致，Notch1 表達最高，Notch4，DLL3 及 DLL4 幾乎不表達（圖 1-3）。

圖 1-2 γ-分泌酶抑制劑 CE 抑制 BMP9 誘導(dǎo) iMEFs 晚期鈣鹽沉積（100×）Figure1-2 γ-secretase inhibitor CE depressed BMP9-induced calcium precipitation of iMEFs（100×）2.2 間充質(zhì)干細(xì)胞 iMEFs 內(nèi)源性 Notch 受體及配體基因表達情況提取 iMEFs 細(xì)胞總 RNA，通過 RT-PCR 檢測 iMEFs 細(xì)胞內(nèi)源性 Notch 受體Notch1-Notch4）及配體（Jagged1，2，DLL1，3，4）表達情況。結(jié)果顯示，Notch族各成員表達非常不一致，Notch1 表達最高，Notch4，DLL3 及 DLL4 幾乎不表（圖 1-3）。

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 郭建剛 ,趙然 ,侯桂英 ,王芳軒;骨組織成分與Masson三色染色反應(yīng)的關(guān)系分析[J];中醫(yī)正骨;2001年11期

本文編號：2745706