【摘要】：在秀麗線蟲中,胰島素信號受體蛋白DAF-2的突變可以將線蟲的壽命延長將近一倍,而此長壽表型又完全依賴于叉頭轉錄因子FoxO在線蟲中的同源蛋白DAF-16的活性。這強烈暗示衰老是受到遺傳機制調控的。線蟲胰島素信號通路也因此成為了最近幾十年中衰老研究的主要對象之一。目前,針對線蟲胰島素信號通路開展的研究工作主要集中在單基因水平和轉錄組水平,對于胰島素信號對線蟲蛋白質組的整體影響仍然所知甚少。僅有的一些研究線蟲胰島素信號通路突變體蛋白質組的工作,定量數(shù)目較少,整體覆蓋率低,不利于系統(tǒng)研究蛋白質組水平的變化。 在本工作中,我建立并優(yōu)化了一整套適用于線蟲樣品的基于N-15穩(wěn)定同位素標記的定量蛋白質組學流程。首先,根據(jù)線蟲樣品的特點,分別優(yōu)化了樣品制備方法、離線預分離方法以及色譜質譜方法。其次,引入了更為可靠的定量軟件并完善了包括數(shù)據(jù)過濾以及統(tǒng)計分析在內的數(shù)據(jù)后處理流程。該流程具有很好的技術可重復性和生物樣品可重復性,定量結果可靠性高且具有較高的蛋白質組覆蓋度,提供了從線蟲樣品到最終定量結果的完整解決方案。我使用該流程對野生型線蟲和三種胰島素信號通路突變體線蟲(daf-2, daf-2;daf-16, daf-16)的蛋白質組進行了定量研究與比較。在每個線蟲品系的一次生物重復中,平均可以對超過6000個蛋白進行定量,大大超越了有記錄可查的線蟲蛋白組定量數(shù)量。本工作中的蛋白質定量結果與之前類似工作中的定量結果具有高度的一致性。此外,daf-2突變體線蟲中的差異蛋白(與野生型相比)富集了已知的壽命調控基因,這一方面解釋了daf-2突變體線蟲為何具有長壽表型；另一方面則暗示通過詳細研究在daf-2突變體線蟲中差異表達的蛋白質,更有可能發(fā)現(xiàn)新的壽命調控基因。 利用此定量蛋白質組數(shù)據(jù),我評價了DAF-16活性在重塑daf-2突變體線蟲蛋白質組中的作用。分析表明,表達量在daf-2突變體線蟲和野生型線蟲之間存在差異的蛋白中,有且僅有約70%依賴于DAF-16的活性。與此相一致的是,在daf-2突變體線蟲中表達量顯著上調的蛋白質的編碼基因的promoter區(qū)并不富集已知的DAF-16結合元件,盡管其中依賴于DAF-16的那一部分上調蛋白質的編碼基因的promoter區(qū)可以顯著富集DAF-16結合元件。有趣的是,表達量在daf-2突變體線蟲中顯著下調的基因,無論該下調是否依賴于DAF-16,其編碼基因的promoter區(qū)均無法富集到已知的DAF-16結合元件。這指出不依賴于DAF-16轉錄活性或間接依賴于DAF-16轉錄活性的調控機制對重塑daf-2突變體線蟲蛋白質組起到了至關重要的作用。 通過比較蛋白質組與轉錄組學數(shù)據(jù),我發(fā)現(xiàn)mRNA水平的變化和蛋白質水平的變化在總體上的相關性僅為0.38(spearman相關系數(shù)),相當一部分蛋白質的表達量變化無法用其mRNA水平的變化來解釋。說明轉錄后調控機制對重塑daf-2突變體線蟲蛋白質組也起到了關鍵作用。進一步分析發(fā)現(xiàn),相比于在mRNA和蛋白質水平都下調的基因,僅在蛋白質水平發(fā)生下調的基因擁有更長、也更易于形成二級結構的3’UTR序列。這暗示包括microRNA在內的一系列轉錄后調控機制可能參與了胰島素信號對蛋白質組的重塑過程。 通過對差異表達蛋白進行深入的功能分析,我發(fā)現(xiàn)包括糖酵解、脂肪酸分解以及氨基酸分解在內的三大營養(yǎng)物質的分解產(chǎn)能過程在daf-2突變體線蟲中得到了全面加強,而包括mRNA轉錄和蛋白質翻譯在內的生物大分子合成過程在daf-2突變體線蟲中受到了廣泛的抑制。進一步的生物實驗驗證表明,干擾核糖體RNA的轉錄后修飾過程可以進一步延長daf-2突變體線蟲的壽命,這很有可能是通過進一步降低蛋白質翻譯過程來實現(xiàn)的。 網(wǎng)絡分析表明,表達量在daf-2突變體線蟲中發(fā)生變化的蛋白質在蛋白質相互作用網(wǎng)絡中居于更加中心的位置,它們擁有更高的度和介數(shù),與網(wǎng)絡中其他蛋白的距離也更近。我進一步將包含了差異蛋白的子網(wǎng)絡分解成了若干模塊,對主要模塊的功能進行了分析,并找到了聯(lián)系不同模塊的重要的蛋白-蛋白相互作用,以期對最終闡明daf-2突變體線蟲差異蛋白質組的內部結構做出貢獻。
【學位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學院
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R3411
【圖文】：

于以下兩個原則[1^:首先，自然選擇的壓力隨著年齡的增長不斷減弱；其次，生殖過程與體細胞的維持過程相互競爭有限的能量和資源。（圖1-1)ORGANISMResources Growth Maintenance and RepairStorage ReproductionProgeny圖1-1在自然選擇的壓力之下，生物有機體根據(jù)環(huán)境條件在各耗能過程之間分配資源（引自 Thomas Kirkwood, 2005)3

秀麗線蟲是衰老的遺傳分析中不可多得的優(yōu)秀模式生物，對衰老的機理研究做出了不可磨滅的貢獻。線蟲培養(yǎng)成本低，生命周期短，很多關鍵基因、信號通路以及生理過程都在哺乳動物中保守。事實上，早在作為衰老研究的模式生物之前，線蟲就已經(jīng)成為了遺傳學及分子生物學中常用的模式生物。最早將線蟲引入生物學研究領域的是B「enne「和Sulston[i4' 15]，他們的工作奠定了線蟲的模式生物地位。線蟲的成蟲長1 mm左右，2CrC培養(yǎng)時生殖期有3.5天。實驗室培養(yǎng)線蟲可以用固體或者液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫度在15°C到25r之間，可以比較容易的擴增培養(yǎng)到較大的群體。長期儲存時可以將線蟲用液氮凍起來，化開后仍能存活。5

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本文編號：2722339