VEGF在骨髓間充質(zhì)干細胞向內(nèi)皮細胞誘導分化中的作用及分化機制研究

發(fā)布時間：2020-06-19 10:00

【摘要】：骨髓中的間充質(zhì)干細胞（mesenchymal stem cells, MSCs）在不同的誘導條件下，具有向中胚層和神經(jīng)外胚層組織細胞分化的能力，已成為組織工程的種子細胞。目前，許多文獻報道了關(guān)于MSCs的分離、鑒定、生物學性狀及定向誘導分化.。隨著組織細胞工程學和基因工程學的發(fā)展，利用MSCs的多向分化潛能，在組織工程、基因治療以及器官移植等方面的應(yīng)用研究已成為研究熱點。然而MSCs在血管組織工程中的作用及其與血管內(nèi)皮細胞之間的關(guān)系的研究尚少。 MSCs具有內(nèi)皮細胞的某些表型，因此研究和分析MSCs生長、發(fā)育、分化和表型特征，不僅對研究血管內(nèi)皮細胞相關(guān)疾病的治療有著重要的指導意義，而且給血管組織工程學帶來了一次革命性轉(zhuǎn)變。MSCs作為血管組織工程的種子細胞，具有其他細胞所不可比擬的優(yōu)越性：①取材方便，損傷輕微，不必通過手術(shù)從病人身上得到自身成熟細胞，避免對病人造成不必要的二次創(chuàng)傷；②從患者本人骨髓血培養(yǎng)擴增的MSCs誘導為血管內(nèi)皮細胞，不存在組織相容性問題；③體內(nèi)成熟內(nèi)皮細胞其分裂增殖能力有限，且還存在去分化形成腫瘤的傾向。MSCs具有旺盛的增殖分化潛能，無誘導劑情況下可保持25代內(nèi)無分化趨勢，并且MSCs在體內(nèi)具有免疫調(diào)節(jié)作用，至今未 WP=112 見體內(nèi)發(fā)生腫瘤的報導；④人工合成材料的可降解性材料聚乙二醇酸PGA、聚丙醇酸PLA、聚乙醇酸PLLA，與MSCs相結(jié)合使用，將會給血管組織工程學帶來不可估量的使用前景。殖分化潛能，無誘導劑情況下，可保持25代內(nèi)無分化趨勢。細胞分化程序的啟動和進行是多個基因有次序的開啟/關(guān)閉或表達增強/降低的結(jié)果，受細胞與細胞（包括間質(zhì)細胞如成纖維細胞、肥大細胞等）、細胞與細胞外基質(zhì)間相互作用的影響。細胞因子在傳遞細胞與胞外基質(zhì)之間、細胞與細胞之間的信息中起重要作用。 Flt-1/VEGF，F(xiàn)lk-1/VEGF系統(tǒng)在內(nèi)皮細胞增殖分化、內(nèi)皮細胞游走及管腔形成過程中起重要作用并且大量實驗表明VEGF在內(nèi)皮細胞誘導分化過程中起著關(guān)鍵的作用。細胞外基質(zhì)成分的改變也影響干細胞的分化，胞外某些信息通過細胞外基質(zhì)傳遞給干細胞，以觸發(fā)跨膜信號傳導，調(diào)控細胞的基因表達。這一過程不僅改變干細胞的分裂方式，而且也激活干細胞的多潛能性，使干細胞產(chǎn)生一種或多種定向祖細胞，以適應(yīng)組織修復的需要。本研究擬通過免疫熒光、全細胞膜片鉗技術(shù)、激光共聚焦顯微鏡實時監(jiān)控技術(shù)及三維圖象重組技術(shù)、Bodyen 小室技術(shù)、體外血管形成實驗，從形態(tài)學、電生理等多角度逐漸深入地研究VEGF在MSCs內(nèi)皮細胞誘導分化過程中所起的作用；并利用抑制性消減雜交技術(shù)從分子水平上尋找內(nèi)皮細胞分化的機理，探討MSCs 作為血管組織工程種子細胞的可能性。結(jié)果： 1．本實驗在貼壁篩選與密度梯度離心法相結(jié)合的基礎(chǔ)上，傳代過程中與篩網(wǎng)過濾法結(jié)合，除去少量已分化或老化的體積較大而扁平的細胞（mMSCs），使細胞純度達95%，平均為93.26±2.48％。與以往部分研究不同，CD29陰性，CD44陽性率達95%，說明分離的細胞群純度較高。 WP=113 2．MSCs的細胞生物學特征及電生理特征研究甚少。本實驗發(fā)現(xiàn)，MSCs中S+G2 期的細胞約占18%,而G1期的細胞為 82 % (即靜止期細胞 ) ,只有少數(shù)細胞處于活躍的增殖期。在對原代、凍存后復蘇及傳代培養(yǎng)至P12的MSCs的染色體核型分析中發(fā)現(xiàn)其保持穩(wěn)定的二倍體核型且核型正常，因此，從細胞生物學角度進一步證實MSCs有望成為穩(wěn)定培養(yǎng)的細胞系，作為細胞治療的種子細胞。 3．MSCs細胞上存在電壓依賴型鈣通道（VOCCs）。其峰值電流(ICa-Peak)在+30 - +40mV為（97.83±8.98，pA，n=8），此電流可被10uM的Nicardipine阻斷從而證實為細胞的鈣通道電流。 4．MSCs具備內(nèi)皮分化的細胞免疫學基礎(chǔ)。表達早期內(nèi)皮細胞分化標志和EPC(內(nèi)皮前體細胞)標志之一Flk-1，表達Flt-1，與早期內(nèi)皮細胞發(fā)育有關(guān)。 5．全細胞膜片鉗技術(shù)觀察VEGF作用下MSCs細胞內(nèi)Ca2+ 峰值電流升高，（實驗組與對照組分別為110.00±7.62、97.50±7.01 (p0.05),pA,n=9）。與對照組相比VEGF組有統(tǒng)計學意義(P0.05)，說明MSCs能接受VEGF刺激，引起胞內(nèi)鈣離子濃度發(fā)生相應(yīng)變化。 6．給予VEGF165刺激，細胞內(nèi)Ca2+開始上升，經(jīng)12秒趨于平穩(wěn)，持續(xù)10秒后達到高峰，后開始下降，VEGF使細胞內(nèi)Ca2+波動后維持在比加藥前稍高的細胞內(nèi)Ca2+水平上（P0.001），提示VEGF作用于MSCs后，細胞內(nèi)Ca2+經(jīng)各種信號分子調(diào)節(jié)而波動后，細胞可重新建立新的鈣平衡，即在無細胞鈣毒性前提下提高了細胞內(nèi)靜息鈣水平，而這種變化對于MSCs分化具有重要意義。 7．利用LSCM實時動態(tài)監(jiān)測了MSCs在Matrigel/VEGF和Matrigel/內(nèi)皮細胞條件誘導液構(gòu)成的內(nèi)皮細胞生長微環(huán)境中的運動遷移情況，發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮細胞條件誘導液促進MSCs的遷移，在Matrigel內(nèi)遷移的深度及遷移至聚碳酸脂 WP=114 膜下的細胞均明顯多于對照組（p〈0.05），而VEGF組遷移的深度雖高于對照組（p〈0.05），但遷移至聚碳酸脂膜下的細胞與對照組相比，并無統(tǒng)計學意義（p〉0.05），說明MSCs在細胞外基質(zhì)的微環(huán)境遷移過程中，VEGF確實發(fā)揮一定作用，但還需其它各種復雜成分的協(xié)同參與。 8．VEGF組能夠形成管腔樣結(jié)構(gòu)，內(nèi)皮細胞條件培養(yǎng)液組形成管腔樣
【學位授予單位】：吉林大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2004
【分類號】：R329
【圖文】：

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