【摘要】： 背景 目前研究認為，microRNAs(miRNAs)廣泛參與了機體多種生理、病理過程的調控，miRNAs已成為生命科學研究領域的熱點。MicroRNA-21(MiRNA-21)作為一種具有顯著抗癌細胞凋亡作用的特殊miRNA，在腫瘤領域尤其引人關注。MiRNA-21通過對其重要靶基因程序化細胞死亡分子4(PDCD4)的調節(jié)是miRNA-21發(fā)揮抗癌細胞凋亡作用的重要機制之一。近年發(fā)現(xiàn)miRNA-21在血管平滑肌細胞和心肌細胞中也存在miRNA-21的表達。MiRNA-21通過調節(jié)PDCD4的表達參與了血管平滑肌細胞和心肌細胞的凋亡、增殖及對抗氧化應激引起的細胞損傷等重要過程，提示miRNA-21及其靶基因PDCD4可能在心血管領域具有重要的生物學作用。但miRNA-21在血管內皮中的表達、調節(jié)和功能目前尚不清楚。糖尿病狀態(tài)下高濃度葡萄糖引起血管內皮細胞凋亡增加和細胞功能受損，導致內皮屏障破壞被認為是糖尿病誘發(fā)動脈粥樣硬化發(fā)生、發(fā)展的重要環(huán)節(jié)。MiRNA-21的表達調節(jié)是否參與了糖尿病狀態(tài)下血管內皮細胞的凋亡損傷過程目前未見相關研究報道。 目的 研究miRNA-21在高濃度葡萄糖作用下血管內皮細胞中的表達變化情況，探討miRNA-21是否通過調節(jié)PDCD4的表達參與了高糖誘導的血管內皮細胞凋亡損害過程。 方法 (1)用不同濃度D一葡萄糖(5．5mM、11mM、22mM及33 mM)孵育人臍靜脈內皮細胞(HUVECs)48小時。實時定量RT-PCR方法檢測細胞中miRNA-21表達和PDCD4、Bax、Bcl-2及Caspase-3的mRNA表達情況；用Western blot方法檢測PDCD4、Bax及Bcl-2蛋白在細胞中的表達變化；用分光光度計法檢測HUVECs中的Caspase-3的活性變化；Hoechst33342／PI雙熒光染色觀察細胞凋亡；MTT法檢測不同濃度葡萄糖作用下HUVECs的增殖情況。 (2)HUVECs中miRNA-21干擾抑制實驗： 用脂質體Lipofectamine~(TM) 2000將不同濃度的miRNA-21抑制劑2’OMe-miRNA-21(分別為3nM、10 nM、30 nM及100 nM)轉染到低血清OPTI-MEM培養(yǎng)基孵育的HUVECs中，5h后換含33mM葡萄糖DMEM完全培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)48小時。實時定量RT-PCR方法檢測miPNA-21干擾抑制48小時后HUVECs中miRNA-21表達和PDCD4、Bax、Bcl-2及Caspase-3的mRNA表達情況；Western bolt法檢測PDCD4、Bcl-2及Bax的蛋白表達水平；用分光光度計法檢測HUVECs中的Caspase-3的活性變化；Hoechst33342／PI雙熒光染色觀察細胞凋亡；MTT法檢測HUVECs的增殖情況。 (3)HUVECs中miRNA-21過表達實驗： 用脂質體Lipofectamine~(TM) 2000將10nM和30hM的miRNA-21模擬物轉染到低血清OPTI-MEM I培養(yǎng)基孵育的HUVEECs中，5h后換含5．5mM或33mM葡萄糖的DMEM完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48小時。實時定量RT-PCR方法檢miRNA-21過表達48小時后HUVECs中miRNA-21表達和PDCD4、Bax、Bcl-2及Caspase-3的mRNA表達情況；Westernbolt法檢測PDCD4、Bcl-2及Bax的蛋白表達水平；用分光光度計法檢測HUVECs中的Caspase-3的活性變化；Hoechst33342／PI雙熒光染色觀察細胞凋亡；MTT法檢測HUVECs的增殖情況。 結果 (1)隨著葡萄糖濃度(5．5mM、11mM、22mM及33 mM)的增加，HUVECs中miRNA-21的表達水平呈濃度依賴性降低(p0．01)，PDCD4的蛋白表達水平增加(p0．05)，但對PDCD4的mRNA表達無影響(p0．05)：高濃度葡萄糖呈濃度依賴性下調HOVECs中Bcl一2的mRNA及蛋白表達水平(p0．05)，同時上調Bax的ⅢRNA及蛋白表達(p0．05)，Bax／Bcl-2的mRNA和蛋白表達比值也明顯增加(p0．01)；高濃度葡萄糖呈濃度依賴性升高Caspase-3的mRNA表達和Caspase-3活性水平(p0．05)，細胞凋亡增加(p0．05)，同時降低細胞增殖活性水平(p0．05)。 (2)10nM、30nM及100nM／的2’OMe-miRNA-21呈濃度依賴性明顯降低33nM葡萄糖孵育的HUVECs中miRNA-21的表達(P0．01)，明顯上調PDCD4的蛋白表達水平(p0．01)，而不同濃度miRNA-21抑制物對33mM葡萄糖孵育的HUVECs中PDCD4的mP,NA表達無影響(p0．05)。 (3)10nM、30nM及100nM的2’OMe-miRNA-21呈濃度依賴性降低33mM葡萄糖孵育的HUVECs中Bcl-2的mRNA及蛋白表達(p0．05)；顯著增加Bax的mRNA及蛋白表達(p0．01)，Bax／Bci-2的mRNA及蛋白表達比值明顯升高(p0．01)。顯著升高Caspase-3的mP,NA表達和Caspasel3活性(p0．01)，細胞凋亡明顯增加(p0．01)，同時降低細胞增殖水平(p0．05)。 (4)10nM和30nM的miRNA-21模擬物均明顯增加5．5mM或33mM葡萄糖孵育下HUVECs中miRNA-21表達水平(p0．01)，顯著降低PDCD4的蛋白表達(p0．01)，但對不影響PDCD4的mRNA表達水平(p0．05)。相同劑量的miRNA-21模擬物引起33mM葡萄糖孵育下HUVECs中miP,NA-21及PDCD4蛋白表達的變化程度強于5．5mM葡萄糖孵育下HUVECs中相關指標的變化(p0．05)。 (5)30nM的miRNA-21模擬物明顯上調5．5mM和33mM葡萄糖孵育下HUVECs中Bcl-2的mP,NA及蛋白表達水平(p0．01)，同時下調Bax的mRNA及蛋白表達(p0．01)，Bax／Bel-2的mRNA和蛋白表達比值顯著降低(p0．01)。細胞中Caspase-3的mP,NA表達和Caspase-3的活性水平明顯減少(p0．01)。細胞凋亡數(shù)明顯減少(p0．01)，而細胞增殖活性增加(p0．05)。30nM的miRNA-21模擬物對33mM葡萄糖孵育下HUVECs中Bax／Bcl-2的mIWA和蛋白表達比值、Caspase-3的mP,NA表達、Caspase-3的活性、凋亡細胞數(shù)及細胞增殖活性水平的變化程度影響均低于5．5mM葡萄糖孵育下HUVECs中相關指標的變化(p0．05)。 結論 (1)高濃度葡萄糖可降低血管內皮細胞中miP,NA-21表達水平，同時增加PDCD4的蛋白表達。MiP,NA-21通過轉錄后抑制的方式調節(jié)PDCD4的表達，PDCD4是血管內皮細胞中miRNA-21的重要作用靶基因。 (2)MiP,NA-21通過調節(jié)PDCD4表達參與了高糖誘導的血管內皮細胞的凋亡過程，并影響細胞的增殖。 (3)MiRNA-21在血管內皮細胞中的表達變化可影響B(tài)ax／Bcl-2系統(tǒng)在細胞內的平衡，miRNA-2l與Bax／Bcl-2體系可能共同參與了高糖誘導的血管內皮細胞凋亡過程。
【學位授予單位】：中南大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2010
【分類號】：R363
【圖文】：

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本文編號：2719471