發(fā)布時(shí)間：2020-06-08 07:33

【摘要】：目的： 1、建立體外培養(yǎng)、擴(kuò)增小鼠骨髓源性樹(shù)突狀細(xì)胞(dendritic cells, DC)的方法，觀察核因子-κB寡聚脫氧核苷酸誘騙劑(NF-κB ODN Decoy)對(duì)DC成熟以及生物免疫學(xué)特性的影響， 2、建立中波紫外線(UVB)照射誘導(dǎo)脾細(xì)胞凋亡的方法，觀察NF-κB ODN Decoy處理DC吞噬同種凋亡脾細(xì)胞(Apo-SCs)的能力以及吞噬后DC生物免疫學(xué)特性的變化，探討DC交叉提呈和交叉致敏的作用機(jī)制，進(jìn)而探討誘導(dǎo)交叉耐受的方法。 3、建立同種異體小鼠異位心臟移植模型，觀察移植術(shù)前輸注NF-κB ODN Decoy處理的供者或／和吞噬供者凋亡細(xì)胞的受者DC對(duì)小鼠移植心臟存活的影響，探討NF-κB ODN Decoy處理的供受者DC誘導(dǎo)移植免疫耐受的可能機(jī)制。 方法： 1、體外分離骨髓前體細(xì)胞，在重組小鼠粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(rmGM-CSF)刺激下，手法篩選，培養(yǎng)擴(kuò)增小鼠骨髓來(lái)源DC(BM-DC)。應(yīng)用特異性NF-κB ODN Decoy處理DC，觀察DC的形態(tài)、細(xì)胞表面分子表達(dá)、吞噬功能以及同種混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)的變化，了解NF-κB ODN Decoy對(duì)DC成熟和生物免疫學(xué)特性的影響。 2、采用UVB照射的方法，誘導(dǎo)脾細(xì)胞凋亡，并通過(guò)流式細(xì)胞儀(FCM)檢測(cè)凋亡的誘導(dǎo)情況；將同種凋亡脾細(xì)胞(Apo-SCs)與DC共同培養(yǎng)，并用NF-κB ODN Decoy預(yù)處理DC(Decoy Apo-SCs DC)，應(yīng)用FCM和熒光顯微鏡，了解DC吞噬同種凋亡細(xì)胞的能力。通過(guò)FCM檢測(cè)DC表面分子表達(dá)的變化情況，通過(guò)初次混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)了解Decoy Apo-SCs DC刺激同種T細(xì)胞的增殖能力，并用Decoy Apo-SCs DC預(yù)致敏小鼠行再次混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)，觀察Decoy Apo-SCs DC交叉致敏和交叉耐受同種T細(xì)胞的能力。 3、采用腹腔雙血管端側(cè)吻合法建立同種小鼠異位心臟移植模型，以BALB／c小鼠為供者、C57BL／6小鼠為受者，移植術(shù)前7天經(jīng)門(mén)靜脈輸注不同方法處理的DC(2×10~6cells)預(yù)處理受者小鼠，根據(jù)輸注DC的不同將實(shí) NF·KBOONOecoy處理的供交者樹(shù)突狀細(xì)胞誘一導(dǎo)免度耐史的實(shí)臉研究 中文摘要 驗(yàn)小鼠分為7組:①對(duì)照組(Colltrol):受者一于術(shù)前7天經(jīng)門(mén)靜脈單純 輸注o.Zml磷酸鹽緩沖液(pBs);李)DC組:輸注未經(jīng)NF一KB ODN Deeoy 處理的供者來(lái)源BM一DC;③Deeoy DC組:輸注NF一KB ODN neeoy處理 的供者來(lái)源BM一oC;④Apo一ses DC組:輸宜i:NF一KB OnN Deeoy未處 理的吞噬同種Apo一SCs的受者來(lái)源BM一DC;⑤Deeoy Apo一sCs De組: 輸注NF一KB oDN Deeoy處理的吞咪供體Apo一SCs的受者De;⑥聯(lián)合輸 注組:聯(lián)合輸注NF一KB ODN Decoy處理的供者來(lái)源DC和吞噬供體 Apo一ses的受體來(lái)源De;⑦第三供體組(3「d party):以e3H/HeJ為供 體，受者的處理與第6組相同。觀察各組小鼠移植心臟的存活時(shí)間和組 織病理學(xué)改變，采用半定量RT一PCR方法檢測(cè)小鼠移植心臟組織中細(xì)胞 因子IL一2、IIJ一10和 IFN一丫mRNA的表達(dá)水平。 結(jié)果: l 在:mGM一CSF刺激下，可從小鼠骨髓培養(yǎng)擴(kuò)增l上}大量的DC，每只小鼠 獲得BM一Dc約10一2。又1。“個(gè)，完全能滿(mǎn)足本實(shí)驗(yàn)的需要。 NF一KB oDN Decoy處理的DC，在形態(tài)上表現(xiàn)為未成熟狀態(tài)，細(xì)胞表面 共刺激分子CDSO、CD86、CO40等表達(dá)明顯低下，并抑制了IL一12的分 泌，阻礙了DC的發(fā)育成熟，這種陽(yáng)礙作用不可被脂多糖(LPS)等刺激 所逆轉(zhuǎn)�；旌狭馨图�(xì)胞反應(yīng)顯示，NF一KB ODN Decoy可抑制DC刺激同 種淋巴細(xì)胞的增殖反應(yīng)和T細(xì)胞分泌Thl型細(xì)胞因子。 UvB照射可有效誘導(dǎo)脾細(xì)胞的凋獷。FcM檢測(cè)顯示，uvB(20omJ/cmZ) 照射后繼續(xù)培養(yǎng)12一18小時(shí)，，可獲得近90%的凋亡脾細(xì)胞。 DC可有效吞噬同種凋亡脾細(xì)胞。凋!、脾細(xì)胞與DC共同孵育48小時(shí)后， FCM檢測(cè)和熒光顯微鏡結(jié)果顯示，DC可有效吞噬同種凋亡脾細(xì)胞。 NF一KB ODN Decoy可抑制DC吞哎同種凋亡脾細(xì)胞后的成熟。DC與同 種凋亡脾細(xì)胞共同孵育，刺激了Dc的成熟表型;NF一KB ODN Decoy預(yù) 先處理DC，抑制了吞噬同種凋一亡脾細(xì)胞所引起的DC成熟。 初次混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)顯示，Decoy Apo一Scs DC可明顯抑制同種T細(xì)胞 的體外增殖反應(yīng);再次混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)結(jié)果顯示，Decoy Ap。一Scs Dc 可誘導(dǎo)同種T細(xì)胞抗原特異性免疫低反應(yīng)和交叉耐受。 成功建立了穩(wěn)定的同種異體小鼠異位心臟移植模型，同系小鼠間 (C57BL/6一C57BL/6)移植心臟的存活時(shí)!’司100天。 各組同種異體小鼠移植心脫(B八LB/c*C57BL/6)的平均生存時(shí)間 (MST)分別是:對(duì)照組7.1天，DC爹!}8.4人，Deeoy DC組20天，Apo一SCs DC至[l‘5.1天，Deeoy Apo一SCs De全11 33.3天，聯(lián)合輸注組65.1天，第三 NF一KBOONOecoy叱理的供交者樹(shù)突狀細(xì)胞誘導(dǎo)免攻耐交的實(shí)臉研兄 中文摘要 供體組(3rd party，e3llzlleJ*e57RLz6)5.7天。Deeoy De組與De組 比較差異有顯著性意義(尸=0.0003、;Deeoy Apo一sCs DC組與Deeoy DC 組和Apo一SCs DC組相比有明顯差異(p== 0.0003和尸二0.0001);聯(lián)合輸 注組移植物的存活時(shí)間最長(zhǎng)，與其它各組相比差異皆有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意 義‘與對(duì)照組P=0.000一:與DC組p一0.0002:與Deeoy DC組P=0.0002: 與Apo一SCs DC組p=0.0001:與Deeoy Apo一SCs DC組p=0.0086:與第三 供體組P=0.0003)。 9、檢測(cè)小鼠移植心臟組
【圖文】：

骨髓前體細(xì)胞培養(yǎng)48小時(shí)，手法篩選前、后倒置顯微鏡觀察結(jié)果(x100)

圖2.培養(yǎng)第5天的各組DC倒置顯微鏡觀察結(jié)果(x200)A:Control一DC，細(xì)胞開(kāi)始從集落中釋放，可見(jiàn)少量的樹(shù)枝狀突起;B:LPS一DC，細(xì)胞大量從集落中釋放，可見(jiàn)大量的長(zhǎng)短不一的樹(shù)枝狀突起;C:Deeoy一DC，僅有少量的細(xì)胞從集落中釋放，細(xì)胞表面的突起很少;D:LPs一Deeoy一Dc，少量細(xì)胞從集落釋放，細(xì)胞表面突起少，與Decoy一DC相似。二、ne對(duì)Nr一‘BonNneeoy的攝取:為了檢測(cè)De攝取哪一‘BoDNDeeoy能力，將FITC標(biāo)記哪一‘BODNDeeoy與BM一DC共同培養(yǎng)。圖6A、B顯示，被DC攝取，主要分布于DC細(xì)胞核內(nèi)FITC標(biāo)記哪一‘BODNDeeoy可有效的并于2周后仍能在DC內(nèi)觀察到，說(shuō)明
【學(xué)位授予單位】：復(fù)旦大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2004
【分類(lèi)號(hào)】：R392

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本文編號(hào)：2702749