【摘要】：研究表明，人體內(nèi)存在的天然抗角蛋白自身抗體(anti-keratin auto antibody，AK auto Abs)存在于人和多種動物體內(nèi)，構成了免疫系統(tǒng)的基本組成部分，參與免疫自穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié)。在一些病理情況下(如銀屑病、接觸性皮炎等)，AK auto Abs的存在有利于限制病情進展，促進損傷修復，對機體具有保護作用。本室發(fā)現(xiàn)AK auto Abs主動介入某些皮膚病的病理生理過程，無論是來自皮損或者正常人血清的AK auto Abs都以劑量依賴的方式抑制角質形成細胞的增殖和分化；輸注含高滴度AK auto Abs的人血丙種球蛋白，在部分銀屑病患者收到了較好的效果，從血清中提取的AK auto Abs在動物實驗中也初步顯示了有希望的治療應用前景，但由于血液制品的來源和安全性問題而限制了AK auto Abs的臨床應用。 噬菌體展示技術的出現(xiàn)為不經(jīng)免疫制備人源性抗角蛋白抗體提供了可能。國內(nèi)外已經(jīng)從噬菌體抗體庫中成功地制備了多種單克隆抗體，本實驗室從半合成的噬菌體抗體庫中成功地篩選到抗角蛋白的噬菌體抗體Fab和ScFv，并初步得到可溶性表達的抗角蛋白單克隆抗體Fab，其具有較高的特異性和親和力，為抗角蛋白NAA的應用及進一步研究提供了良好的手段。研 第四軍醫(yī)大學博士學位論文 究發(fā)現(xiàn)，這些抗體片段具有抑制培養(yǎng)的角質形成細胞增殖的作用，從噬菌體 抗體庫中篩選出來的抗體分子在很多情況下可滿足應用的需要，但由于沒有 Fc段而不具備抗體的某些生物學功能，如激活補體、ADCC(抗體依賴性細 胞介導的細胞毒作用)以及免疫調(diào)節(jié)等。在某些情況下，尤其用于體內(nèi)治療 時，需要使用完整的抗體分子。親和力是抗體的重要參數(shù)，在體內(nèi)只有親和 力高的抗體才能發(fā)揮有效的生物學作用。在生物技術領域，親和力高的抗體 有著明顯較高的使用價值，因此，對于從噬菌體抗體庫篩選出的抗體，只有 及時評價抗體的親和力，才能選擇出性能優(yōu)良的抗體。為此我們選擇親和力 最高的Fab或scFv克隆，克隆抗體的可變區(qū)基因，構建真核表達載體，脂 質體Lipofeetamine2000轉染二氫葉酸還原酶(DHFR)缺陷的CHO細胞， 在MTx加壓條件下，表達抗人角蛋白全長IgG抗體，并檢測抗體的生物學 活性。 本室己經(jīng)從半合成噬菌體抗體庫篩選出7株抗角蛋白ScFv和4株抗角 蛋白Fab。通過ELISA檢測抗體活性及特異性，并進行了研慫stem blot分析。 篩選親和力最高的抗體克隆尤其重要，而目前通常采用硫氰酸胺法或生物傳 感器來測定抗體的相對親和力，一由于噬菌體ScFv切除基因m后不能自連， 因此不能表達出抗體片段，也無法預知抗體的活性，不能應用生物傳感器測 定抗體的親和力。因此我們利用曾經(jīng)篩選到的4株抗角蛋白噬菌體Fab抗體 片段，通過內(nèi)切酶NFhel切除載體上的基因111，IPTG誘導表達可溶性抗體 Fab片段，應用鎳親和層析柱純化抗體，生物傳感器測定抗體親和力，選擇 親和力最高的克隆。親和力最高的克隆質粒送上海生物工程公司測序，根據(jù) 測序結果和前導序列設計擴增抗體輕、重鏈可變區(qū)(VK和VH)基因以及連 接前導序列的引物。經(jīng)過PCR擴增帶有前導序列的輕、重鏈可變區(qū)基因(LK 和LH)。經(jīng)Xbal和BamHI酶切LK，分別插入同樣酶切的載體pWD和pWSD3， 構建帶有LK的載體pWD、和pWSD3K;經(jīng)Xhol和Hind 111酶切LH，分別插 入同樣酶切的載體pWDK和pWSD3K，構建帶有目的基因輕、重鏈抗體可變區(qū) 基因的真核表達載體pWD出和pwSD3妞。分別進行酶切、PcR和測序鑒定 正確:經(jīng)LipofectamineZo00轉染CHo(dhfr一)細胞，72小時后檢測抗體的瞬 時表達;在氨甲喋吟伽TX)加壓篩選條件下，亞克隆化篩選穩(wěn)定表達的細胞 第四軍醫(yī)大學博士學位論文 系，Rl’- pCR檢測抗體在mRNA水平的表達，ELISA檢測抗人角蛋白全長IgG 抗體的表達，，W七stem blot分析抗體識別角蛋白的相對分子質量;收集表達的 上清液，作用于培養(yǎng)的鱗癌細胞，MTT檢測表達的全長IgG抗體對細胞增 殖的影響。 本實驗發(fā)現(xiàn)，7株人抗角蛋白噬菌體SeFVHAKSS、HAKS 19、HAKS 21、 HAKS 24、HAKS 28、HAKS 31和HAKS 41能特異性識別人角蛋白，而與 轉鐵蛋白、胰蛋白酶、人工gG、TRP一1等抗原無交叉結合反應，其識別角蛋 白的相對分子質量約在56 000一57 000之間，包括角蛋白K5和K6;DNA測 序表明HAKSS、19和21的VL屬人19入鏈第二亞群，HAKS 24和28的VL 屬人Ig入鏈第一亞群，HAKS31和41的vL屬人IgK鏈第三亞群;HAKSS 的重鏈可變區(qū)基因(vH)屬人IgG第一亞群，噬菌體HAKS 19、21、24、 24、31和41的VH屬第三亞群。其中HAKS 31和41的輕重鏈完全一樣， 是同一個克隆;經(jīng)過硫氰酸胺檢測，HAKss和HAKS19的相對親和力最小， 較接近;HAKS28、31和HAKS41的相對親和力最大，比較一致;HAKS 21 和HAK24的相對親和力較接近;7株角蛋白噬菌體scFv的相對親和力由大 到小為:HAKS 31二HAKS 41二HAKS 28HAKS藝1、HAKS 24)HAKSS、HAKS 19; 由于噬菌體ScFv不能表達出可溶性抗體片段，無法應用生物傳感器較精確 地測定抗體的親和力。因此我們利用曾經(jīng)篩選到的4株抗角蛋白噬菌體Fab 抗體，通過表達和純化可溶性抗體Fab片段，應用生物傳感器測定抗體的相 對親和力，在4株抗角蛋白噬菌體Fab片段中來選擇親和力最高的抗體，結
【圖文】：

1.1抗角蛋白噬菌體scFv的特異性鑒定:經(jīng)ELISA檢測有7株ScFv與角蛋白均有良好的結合活性，與轉鐵蛋白、胰蛋白酶、GST和TRPI等無關抗原不結合或反應很弱，具備特異性(見圖2)。這7株抗體分別稱為HAKSS、HAKS19、HAKSZI、HAKS24、HAKS28、HAKS31和HAKS41。圖2抗角蛋白噬菌體ScFv的特異性檢測Fig2ELISAresultsofanti一keratinPhageScFvagainstdifferentantigens1.27株抗角蛋白噬菌體scFv的相對親和力經(jīng)過硫氰酸胺檢測，HAKSS和HAKS19的相對親和力最小，較接近;HAKS28、31和HAKS41的相對親和力最大，比較一致;HAKSZI和HAKS24的相對親和力較接近;7株角蛋白噬菌體ScFv的相對親和力由大到小為:HAKS31二HAKS41詡AKS28>HAKSZI“HAKS24>HAKSS“HAKS19(見圖3)。

HAKS21、HAKS24、HAKS28、HAKS31和HAKS41進行染色，均在相對分子質量為56000一57000處出現(xiàn)單一著色條帶，說明各抗體均特異性識別同一角蛋白組分(見圖4)。圖4抗角蛋白SeFv的W七sternblotFig4W七stemblotresultsofanti一keratinScFv
【學位授予單位】：第四軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2004
【分類號】：R392

【參考文獻】

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本文編號：2697167