【摘要】：目的：骨缺損修復(fù)一直是醫(yī)學(xué)研究的重點(diǎn)之一。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow derived mesenchymal stem cells, BMSCs)以其生物學(xué)特性吸引了諸多學(xué)者的目光。氧作為生命活動(dòng)所必需的環(huán)境因素,對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖、分化具有重要的調(diào)節(jié)作用,同樣,氧的存在也是MSCs的存活、增殖和分化過程中不可缺少的條件之一。骨髓中的氧大約是1%-7%pO2,這比一般環(huán)境中的20%低很多。在病理?xiàng)l件下如骨缺損的修復(fù)過程中,MSCs需保持在更低的氧的環(huán)境中發(fā)揮它應(yīng)有的作用。本實(shí)驗(yàn)的目的是研究低氧對(duì)MSCs成骨分化的影響;在MSCs的成骨分化過程中低氧與Notch信號(hào)之間的關(guān)系以及低氧條件下Notch(?)言號(hào)對(duì)MSCs成骨分化影響的機(jī)制。 方法：在1%pO2(低氧)或21%pO2(正常氧)氧下培養(yǎng)MSCs,對(duì)目的細(xì)胞分別進(jìn)行ALP活性分析,實(shí)時(shí)PCR指定基因表達(dá)分析, ARS著色礦化檢測；在MSCs分化過程中通過實(shí)時(shí)PCR在7天、14天、21天的時(shí)候檢鋇(?)Notch1的表達(dá)水平,通過免疫印跡檢鋇(?)Notch1的蛋白表達(dá)水平；Notch1專一性的慢性病毒調(diào)節(jié)shRNA注入MSCs以抑偉(?)Notch(?)言號(hào)活性；在成骨誘導(dǎo)條件下培養(yǎng)7天以后,觀測ALP活性、Runx2、OPN和OCN的mRNA表達(dá)水平及成骨礦化水平；在低氧和正常氧條件下測量Runx2在對(duì)照Notch1-shRNA轉(zhuǎn)染MSCs中和Notch1-shRNA轉(zhuǎn)染MSCs中蛋白表達(dá)水平；免疫沉淀實(shí)驗(yàn)研究Notch1和Runx2的關(guān)系；使用骨鈣素和纖連蛋白啟動(dòng)子熒光素酶實(shí)驗(yàn)測Runx2的轉(zhuǎn)錄活性。 結(jié)果：體外培養(yǎng)后細(xì)胞的ALP活性在低氧條件下比正常氧條件下低很多(p0.01)；實(shí)驗(yàn)組低氧組中三種基因的表達(dá)水平比正常氧條件下低很多(p0.01)；相應(yīng)的,在形態(tài)學(xué)表現(xiàn)上,低氧條件下培養(yǎng)的MSCs分化的礦化水平相比正常氧條件下顯著降低(p0.01)。實(shí)時(shí)PCR在7天、14天、21天的時(shí)候檢測(?)Notch1的表達(dá)水平發(fā)現(xiàn)與正常氧相比,Notch1(?)勺表達(dá)在低氧條件下顯著升高。和(?)mRNA水平一致,Notch1在低氧條件下培養(yǎng)的MSCs7天、14天、21天各個(gè)時(shí)間點(diǎn)中的蛋白表達(dá)水平顯著增加。Notch1專一性的慢性病毒調(diào)節(jié)shRNA被注入MSCs來抑制Notch信號(hào)活性。Notch1的表達(dá)被shRNA明顯抑制。當(dāng)Notch1shRNA和控制shRNA轉(zhuǎn)化的MSCs在成骨誘導(dǎo)條件下培養(yǎng)7天以后,在對(duì)照組細(xì)胞中,ALP活性在低氧條件下比在正常氧條件下低很多；在Notch1抑制的細(xì)胞中,ALP活性差異在兩種條件下不明顯。除此之外,Runx2, OPN和OCN的mRNA表達(dá)水平在控制(?)shRNA轉(zhuǎn)化組中低氧和正常氧下差別很大,但在Notch1shRNA轉(zhuǎn)化組中就不明顯。相同的,礦化水平差異在shRNA轉(zhuǎn)化細(xì)胞中不明顯,但是在對(duì)照組中就很明顯。我們進(jìn)一步研究了低氧通過Notch信號(hào)抑制MSCs成骨分化的機(jī)制�；赗unx2對(duì)于成骨細(xì)胞分化是很關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄因子,在低氧和正常氧條件下測量Runx2在對(duì)照Notch1-shRNA轉(zhuǎn)染MSCs中和Notch1-shRNA轉(zhuǎn)染MSCs中蛋白表達(dá)水平。不管是在低氧還是正常氧條件下,Notch1抑制都可導(dǎo)致Runx2的上調(diào)。另外,免疫沉淀實(shí)驗(yàn)顯示Notch1可以綁定在Runx2上。為了進(jìn)一步研究Notch1和Runx2之間綁定的功能性結(jié)果,在對(duì)照組和Notch1shRNA轉(zhuǎn)染組中Runx2的轉(zhuǎn)錄活性通過使用骨鈣素和纖連蛋白啟動(dòng)子熒光素酶實(shí)驗(yàn)測定。Runx2的轉(zhuǎn)錄活性在Notch1抑制后顯著提高。 結(jié)論：低氧抑制MSCs成骨分化；在MSCs的成骨分化過程中低氧可激活Notch信號(hào)；Notch信號(hào)對(duì)于MSCs成骨分化的低氧性損傷是必須的；Notch通過直接綁定在Runx2上抑制Runx2的轉(zhuǎn)錄活性。
【學(xué)位授予單位】：南開大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R329.2

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2694691