發(fā)布時間：2020-06-02 11:16

【摘要】：背景及意義：鉤端螺旋體病是由致病性鉤端螺旋體(簡稱鉤體)感染引起的全球性流行人獸共患傳染病。盡管致病性鉤體血清群、型眾多,但我國流行最廣的致病性鉤體為問號鉤體(Leptospira interrogans)黃疸出血群賴型。巨噬細胞和中性粒細胞均能吞噬鉤體,但僅有巨噬細胞能殺滅吞噬的鉤體。我們以往研究發(fā)現(xiàn),問號鉤體感染的人和小鼠巨噬細胞線粒體有明顯病變,但線粒體相關經(jīng)典的caspase9/3-細胞色素c凋亡信號通路未激活,故線粒體是否參與問號鉤體感染性巨噬細胞凋亡有待于研究證實。我們推測問號鉤體極有可能通過線粒體相關caspase非依賴凋亡誘導因子(apoptosis inducing factor,AIF)和核酸內切酶G(endonuclease G,EndoG)通路誘導巨噬細胞凋亡,研究結果有助于進一步揭示問號鉤體分子及細胞致病機制。 方法：建立問號鉤體黃疸出血群賴型賴株感染小鼠J774A.1巨噬細胞和人THP-1巨噬細胞模型。采用激光共聚焦顯微鏡技術檢測感染前后細胞活性氧(reactive oxygen species,ROS)變化及DNA損傷情況。采用流式細胞術測定感染前后細胞周期及細胞凋亡情況。采用實時熒光定量PCR (qRT-PCR)了解感染前后細胞周期調控以及凋亡相關基因mRNA水平變化。采用Western blot檢測感染前后細胞周期、凋亡相關蛋白表達及相關激酶磷酸化水平。采用siRNA沉默p53基因、抑制劑阻斷靶蛋白的方法,反向驗證上述基因或靶蛋白在問號鉤體感染性巨噬細胞周期阻滯及凋亡中的作用。 結果：問號鉤體感染導致巨噬細胞ROS水平迅速升高,高濃度ROS引起細胞DNA損傷,表現(xiàn)為53BP1蛋白核內聚集及H2AX蛋白磷酸化。DNA損傷使p53蛋白磷酸化激活并上調p21Cip1/WAF1基因表達,Akt激酶去磷酸化導致P27Kip1基因表達上調,p21Cip1/WAF1和p27Kip1蛋白共同引起細胞周期的迅速阻滯于G1期并出現(xiàn)凋亡現(xiàn)象。問號鉤體感染過程中,人和小鼠巨噬細胞Bcl-2家族中促凋亡的Bax、Noxa、Puma蛋白表達上調,抗凋亡的Bcl-2蛋白表達下調,AIF和EndoG蛋白從線粒體釋放至胞漿中,Fas蛋白表達上調并加速募集于細胞膜。p53基因被沉默或p53信號通路被阻斷后,問號鉤體感染引起的巨噬細胞G1期阻滯現(xiàn)象明顯減少、細胞凋亡率也顯著下降。 結論：問號鉤體感染巨噬細胞后可導致胞內ROS迅速升高及DNA損傷,DNA損傷激活的p53通過線粒體相關caspase非依賴p53-Bax/Noxa/Puma-AIF/EndoG信號通路導致巨噬細胞的凋亡。 背景及意義：鉤端螺旋體病由致病性鉤端螺旋體(簡稱鉤體)感染引起的全球性流行人獸共患傳染病,我國也是鉤體病流行的主要疫區(qū)之一。接種疫苗是預防和控制鉤體病流行最為有效的措施。目前普遍使用的鉤體疫苗主要是根據(jù)當?shù)亓餍械臄?shù)種優(yōu)勢鉤體血清群、型制備的多價鉤體全菌死疫苗。然而,致病性鉤體血清群型眾多,不同地區(qū)主要流行的鉤體血清群型存在明顯差異；鉤體疫苗對其未包含的鉤體血清群、型無明顯的保護作用。此外,鉤體疫苗副作用較大,使該疫苗應用受到很大限制。因此,研制對不同鉤體血清群型有交叉保護作用的高效無毒通用性鉤體新疫苗,對于鉤體病預防和控制具有重要意義。 方法：采用PCR擴增我國流行的主要致病性問號鉤體血清群型屬特異性外膜蛋白ligB、loa22、lipL32、groEL和lenA基因,T-A克隆后測序并比較其序列保守性。以問號鉤體黃疸出血群賴型賴株基因組DNA為模板,用PCR擴增上述基因并構建其原核表達系統(tǒng)。采用SDS-PAGE聯(lián)合凝膠圖象分析系統(tǒng),檢查目的重組蛋白rLigB、rLoa22、rLipL32、rGroEL和rLenA表達情況及表達量。采用Ni-NTA親和層析法提純上述重組蛋白,免疫家兔制備相應抗血清及其抗體。采用生物信息學軟件預測LigB、Loa22、LipL32、GroEL和LenA中的T細胞和B細胞(T-B)聯(lián)合抗原表位。采用噬菌體展示系統(tǒng),制備含T-B聯(lián)合抗原表位的重組噬菌體PⅢ蛋白。采用Western blot和ELISA分別鑒定重組PⅢ蛋白中T-B聯(lián)合抗原表位和人工合成T-B聯(lián)合抗原表位肽的免疫反應性。 結果：8群8型問號鉤體均含ligB、loa22、lipL32和groEL基因,但僅有部分受檢問號鉤體血清群型含lenA基因。上述基因氨基酸序列相似性分別為：ligB基因89.42%～98.63%、Ioa22基因92.82%～100%、lipL32基因98.53%～100%、groEL基因96.52%～100%。所構建的各靶基因原核表達系統(tǒng)均能有效表達其重組蛋白。噬菌體展示及Western blot和ELISA結果顯示,LigB中LigB-371、LigB-744、 LigB-1528以及LipL32中LipL32-13、Loa22中Loa22-90、GroEL中GroEL-215是優(yōu)勢T-B聯(lián)合抗原表位。 結論：LigB、Loa22、LipL32和GroEL是問號鉤體屬特異性外膜蛋白,其中LigB-371、LigB-744、LigB-1528、Loa22-90、LipL32-131、GroEL-215是優(yōu)勢T-B聯(lián)合抗原表位,可用于制備通用性問號鉤體多抗原肽(multiple antigenic peptide, MAP)疫苗。 背景及意義：鉤端螺旋體病由致病性鉤端螺旋體(簡稱鉤體)感染引起的全球性流行人獸共患傳染病,但致病性鉤體感染過程中毒力基因表達調控機制不明。RpoN,又稱Sigma54,是一種重要的原核細胞轉錄因子,但敲除RpoN基因導致鉤體死亡。與其他原核細胞Sigma因子不同,RpoN必須被轉錄激活因子——增強子結合蛋白(enhancer binding protein, EBP)激活后才能發(fā)揮轉錄調控作用。迄今RpoN在多種細菌中被證實與氮代謝基因甚至毒力基因表達調控有關,但RpoN在致病性鉤體中迄今未見研究報道。本研究中,我們構建了致病性問號鉤體RpoN的EBP基因(fhlA)敲除突變株,通過突變株與野生株比較,間接了解RpoN對問號鉤體生長繁殖的影響及其調控的靶基因。 方法：采用生物信息學軟件并根據(jù)RpoN調控基因啟動子序列特征,預測并分析了鉤端螺旋體基因組中RpoN、EBP編碼基因及其調控的靶基因。構建RpoN基因原核表達系統(tǒng)并提純目的重組蛋白(rRpoN).采用凝膠遷移試驗(gelelectrophoresis mobility shift assay, EMSA)篩選rRpoN調控的靶基因。采用隨機轉座突變法構建問號鉤體fhlA基因敲除突變株(ΔfhlA)。采用實時熒光定量RT-PCR (qRT-PCR)檢測AfhlA突變株中候選靶基因nRNA水平變化。采用暗視野顯微鏡計數(shù)法測定突變株與野生株在不同pH或氮源條件下生長曲線及菌株形態(tài)變化。采用Western blot法檢測突變株與野生株部分外膜蛋白(outer membrane protein,OMP)表達情況。 結果：致病性問號鉤體黃疸出血群賴型賴株有一個RpoN基因和fhlA和atoC兩個EBP編碼基因以及15個含RpoN啟動子序列的靶基因,非致病性雙曲鉤體三寶壟群Patoc型Patoc1株也有一個RpoN基因,但僅有一個EBP基因(fhlA) EMSA結果顯示,rRpoN可與lpxC(LA2306)、secE(LA3426)、glnA(LA1313)、 amtB(LA3806)以及LA1188、LA1968、LA2430、LA0773基因啟動子序列結合。Δfh1A突變株LA1188、LA1968及amtB基因mRNA水平顯著下調(P0.05),其他靶基因mRNA水平無明顯變化。AfhlA突變株與野生株均可利用NH4Cl和谷氨酰胺作為氮源并正常繁殖,但在缺氮培養(yǎng)基中均不能進入對數(shù)生長期。AfhlA突變株有鉤體典型、活潑的運動方式,但外形變短(野生株21.7μm,突變株12.2μm)。Western blot結果顯示,受檢的5種OMP中,僅有OmpR表達上調。 結論：致病性鉤體RpoN信號通路較為復雜,可通過FhlA-RpoN或AtoC-RpoN途徑調控靶基因表達。有8個含RpoN啟動子序列的基因能與RpoN結合,其中LA1188、LA1968、氮代謝相關amtB基因表達受Fh1A-RpoN通路調控。Fh1A-RpoN通路還能間接調控OmpR表達。
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結果顯示，NAC預處理J774A.1和THP-1細胞在感染0.5 h后，細胞內出現(xiàn)入侵的病原菌體，0.5-8 h的感染過程中，ROS清除R嵲ご硐赴胛創(chuàng)硐赴啾任尷災圓鉅�。A Time of infection (h)0.5 1 2 4 8J ■■■■■■■IHi!i ■■■■■■■■■■_■■■9

透射顯微鏡結果顯示鉤端螺旋體在感染ROS清除R嵲ご淼南赴輩⒉揮跋煜赴掏倥蕕男緯桑繽，

本文編號：2693074