【摘要】：本論文主要涉及計(jì)算化學(xué)方法開發(fā)及在生物科學(xué)中的應(yīng)用。研究主要包括兩個(gè)方面：通過分子動力學(xué)模擬的方法對蛋白化學(xué)交聯(lián)結(jié)果進(jìn)行預(yù)測和驗(yàn)證；通過計(jì)算模擬和蛋白-蛋白分子對接,以及化學(xué)交聯(lián)等實(shí)驗(yàn)方法對抗糖尿病藥物靶點(diǎn)PPARy小分子配體抑制CDK5/p25介導(dǎo)的PPARy磷酸化修飾的作用機(jī)理研究。 基于質(zhì)譜的蛋白化學(xué)交聯(lián)多肽鑒定技術(shù)是利用小分子將蛋白上特定殘基進(jìn)行共價(jià)交聯(lián)后再通過生物質(zhì)譜鑒定出被交聯(lián)的多肽序列,從而得到這些殘基對在三維結(jié)構(gòu)上的空間距離信息,該方法已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于蛋白-蛋白結(jié)合方式及蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測研究中。雖然目前已經(jīng)有多種預(yù)測蛋白中可交聯(lián)殘基對的計(jì)算方法,但仍然存在一定的問題,因此我們開發(fā)了一種基于分子動力學(xué)模擬的新的計(jì)算預(yù)測方法(XLMD)。該方法不同于其他僅單純考慮空間幾何關(guān)系的預(yù)測方法,通過外加拉力作用于交聯(lián)劑和可修飾的殘基對,來模擬交聯(lián)劑和蛋白之間的相互作用,是目前唯一可以同時(shí)考慮蛋白主鏈和交聯(lián)劑自身合理構(gòu)象變化的方法。我們以文獻(xiàn)報(bào)道的蛋白交聯(lián)數(shù)據(jù)為訓(xùn)練集對XLMD中的關(guān)鍵參數(shù)進(jìn)行了系統(tǒng)的優(yōu)化,并用優(yōu)化后的參數(shù)在另外一些蛋白上進(jìn)行了測試,測試結(jié)果顯示,XLMD假陽性率比已有的Xwalk和Rosetta預(yù)測方法降低了約一半。此外,我們與質(zhì)譜實(shí)驗(yàn)室合作,對兩個(gè)更為復(fù)雜的蛋白進(jìn)行了質(zhì)譜交聯(lián)鑒定和計(jì)算預(yù)測。我們發(fā)現(xiàn)雖然XLMD和Xwalk的預(yù)測中均新出現(xiàn)了一定的假陰性預(yù)測,但XLMD的假陽性預(yù)測數(shù)目仍然比Xwalk少一半以上,并且.與之前提到的相對簡單的蛋白相比XLMD的假陽性率沒有增加,說明基于物理學(xué)基礎(chǔ)的XLMD方法是一種更加穩(wěn)定,可以普遍適用并且成功率更高的蛋白可交聯(lián)殘基對的預(yù)測方法。而且,通過利用更精確的物理模型和模擬方法,XLMD方法具有進(jìn)一步優(yōu)化和提高的潛力。 PPARy小分子配體是一類廣泛使用的糖尿病治療藥物,傳統(tǒng)認(rèn)為的作用機(jī)制是作為激動劑來調(diào)控PPARy的轉(zhuǎn)錄活性。但近年來研究發(fā)現(xiàn)其配體還可以抑制CDK5/p25激酶對PPARy特定絲氨酸的磷酸化,臨床數(shù)據(jù)顯示該磷酸化修飾與胰島素抵抗密切相關(guān),因此PPARy配體的新作用機(jī)制具有極大的臨床應(yīng)用價(jià)值。目前,PPARy小分子配體如何抑制磷酸化的分子機(jī)理仍不清楚,因此我們結(jié)合計(jì)算模擬和實(shí)驗(yàn)的方法對該機(jī)制進(jìn)行了初步探討。首先,對比不同配體結(jié)合下的PPARy構(gòu)象發(fā)現(xiàn),配體結(jié)合并沒有引起PPARy被催化絲氨酸所在區(qū)域明顯的構(gòu)象變化；但通過分子動力學(xué)模擬的方法,我們發(fā)現(xiàn)不同類型的配體對該區(qū)域有不同程度的穩(wěn)定作用。其次,為了進(jìn)一步研究配體是如何影響PPARy與CDK5/p25的結(jié)合,我們一方面采用蛋白-蛋白分子對接的方法對PPARy-CDK5/p25蛋白復(fù)合物的構(gòu)象進(jìn)行了全局剛性搜索和局部柔性搜索,篩選出了比較合理的結(jié)合方式；另一方面與質(zhì)譜實(shí)驗(yàn)室合作,對復(fù)合物進(jìn)行了化學(xué)交聯(lián)和質(zhì)譜鑒定,綜合多次鑒定結(jié)果分析出了6對PPARy與CDK5之間可信的交聯(lián)殘基對。然而從結(jié)構(gòu)上分析發(fā)現(xiàn)這6個(gè)交聯(lián)對之間并不完全兼容,并且有些與發(fā)生磷酸化反應(yīng)所要求的構(gòu)象也不兼容,說明很可能該復(fù)合物不是唯一構(gòu)象。我們進(jìn)一步通過凝膠過濾層析,ITC和SPR的實(shí)驗(yàn)方法發(fā)現(xiàn)它們的相互作用較弱,沒有形成均一穩(wěn)定的復(fù)合物,再次暗示了多種結(jié)合方式同時(shí)存在的可能性。我們用開發(fā)的XLMD方法和質(zhì)譜的鑒定結(jié)果對之前蛋白對接并篩選出的復(fù)合物構(gòu)象做了進(jìn)一步的分析,并最終得到實(shí)驗(yàn)及理論上都比較合理的PPARy-CDK5/p25結(jié)合模式。該部分得到以下結(jié)果與結(jié)論：PPARy配體沒有改變該蛋白的優(yōu)勢構(gòu)象,但可以穩(wěn)定被催化位點(diǎn)附近區(qū)域；PPARy與CDK5/p25的相互作用非常弱并且可能有多種結(jié)合方式；我們篩選并通過交聯(lián)質(zhì)譜和計(jì)算的方法驗(yàn)證了兩種可能的構(gòu)象,并基于這兩種構(gòu)象分析了蛋白結(jié)合過程的關(guān)鍵因素。論文所得結(jié)果可以被用來進(jìn)一步設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)和計(jì)算方案以研究PPARy配體對PPARy-CDK5/p25復(fù)合物結(jié)合的影響。
【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R587.1;R3411

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本文編號：2684145