【摘要】： 目的 先天性馬蹄內(nèi)翻足是一種較常見的先天畸形，患兒一出生即表現(xiàn)為跟骨內(nèi)翻，前足內(nèi)收，跖骨旋后，踝關節(jié)下垂形成馬蹄，以致行走時足外側緣著地�；尾挥绊懟純荷婧蜕�，但嚴重影響其生活質量。馬蹄內(nèi)翻足的病理改變在神經(jīng)、肌肉、骨骼、軟骨及軟組織方面均有表現(xiàn)。關于馬蹄內(nèi)翻足的發(fā)病機制存在宮內(nèi)壓迫、發(fā)育停滯以及遺傳學說，但都缺少足夠明確的證據(jù)。遺傳流行病學研究表明遺傳因素是馬蹄內(nèi)翻足發(fā)病重要因素。由于患兒標本難以取得，且存在加重患兒損傷的風險，建立馬蹄內(nèi)翻足動物模型對深入研究該病具有重要意義。 一切生命活動和生命現(xiàn)象最終要和蛋白質相聯(lián)系，蛋白質才是生命的直接體現(xiàn)者。蛋白質組學是一個新興的研究領域，研究特定病理生理條件下某種組織細胞的全部蛋白質。本實驗擬從蛋白質入手，首先查找相關蛋白，然后據(jù)此尋找馬蹄內(nèi)翻足有關基因。 蛋白質組分析的首要步驟是將來自于全細胞、組織或生物體中多達數(shù)千種混合蛋白質進行分離。雙向電泳技術是目前分辯率最高也最常用的工具，在尋找未知蛋白質、蛋白質組的全景分析、表達特性分析等方面有獨特的功效。通過雙向電泳對蛋白質多肽點進行高度分離純化，輔之以質譜等鑒定技術，并結合生物信息學技術，可用于規(guī)�；粗鞍踪|的篩查和鑒定。 因此，本研究首先利用全反式維甲酸(All-trans retinoic acid，ATRA)誘導孕鼠，探討ATRA誘導馬蹄內(nèi)翻足樣畸形的最佳劑量，建立穩(wěn)定的馬蹄內(nèi)翻足動物模型，為深入研究馬蹄內(nèi)翻足發(fā)病機制提供物質基礎；同時選擇正常Wistar大鼠胚胎肌組織蛋白質組進行雙向電泳分析，建立胚胎肌組織雙向電泳技術平臺；隨后利用雙向電泳分離模型鼠及正常鼠肌肉蛋白質組， 比較模型與正常對照蛋白質點的差異，通過質譜測定結合生物信息學手段 鑒定差異蛋白，為馬蹄內(nèi)翻足的研究提供基礎資料。 實驗方法 1.馬蹄內(nèi)翻足大鼠胚胎模型建立 (1)將孕10d的Wistar近交系大鼠隨機分為對照組和4個實驗組， ArrRA(40m擴nil)用前混懸于礦物油中，用灌胃法按體重分別給予實驗組 大鼠一Zom含‘kg、13om歲kg、135m擴kg、x40 mg/kg，對照組(0 mg/噸組)給 予140m擴kg組相應體積礦物油。 (2)孕21d剖腹取出胚胎，通過胎鼠畸形情況的檢查和結構畸形病理 分析確定內(nèi)翻足樣畸形(足前部內(nèi)收內(nèi)旋，足跟內(nèi)翻，棵關節(jié)下垂，棵角大 于130”)及其他畸形的發(fā)生情況，并記錄死胎，吸收胎數(shù)和活胎體重身長， 經(jīng)數(shù)據(jù)統(tǒng)計處理確定維甲酸最佳誘導劑量。 (3)分別制作馬蹄內(nèi)翻足畸形鼠和正常對照鼠脊髓、椎骨和脛骨后肌 群石蠟切片。參照試劑盒DeadEndT“而orometric TuNEL衍stem說明，對切 片TuNEL法標記作凋亡分析。 2.胎鼠肌組織蛋白質組雙向電泳，每份樣品重復進行三次。 (l)取正常孕Zld胎鼠，實體解剖鏡下脛骨后肌群，吸除液體，冰浴中 搗碎，加少量裂解液研磨成勻漿，補加裂解液至lmF50mg組織，混勻，室溫 放置l小時，離心取上清，定量。 (2)等電、聚焦使用PROTEAN IEF等電聚焦儀。上樣量pH3一10 IpG膠 條為0.5 mg，pHS一IpG膠條為1.omg，上樣體積為350詛。SOv，13h;250v， 30min;IO00v，lh;最后10 000v聚焦60(X心vh。 (3)平衡與SDS電泳經(jīng)兩步平衡后SDS電泳，30v，30分鐘后加壓至 120v，直到嗅酚藍泳出玻璃板前緣為止。 (4)銀染及考瑪斯亮藍染色，圖像利用PDQuest7.0進行分析并標識白 點分子量和等電點。 (5)選清晰匹配點手工切取并進行質譜分析。數(shù)據(jù)查詢使用Peptldent 搜索Swiss~Prot，同時利用Maseot或MS一Fit輔助搜索NCBInr。 3.模型鼠與正常鼠肌肉蛋白質組差異分析 (l)分離模型胎鼠及正常對照胎鼠脛骨后肌群，提取蛋白，等電聚焦， SDS電泳，考馬斯亮藍R一50染色，利用PDQuest軟件對圖像進行分析。 (2)差異分析重點分析高差異蛋白，包括未匹配斑點(僅在正常鼠出 現(xiàn)，或僅在模型鼠出現(xiàn))和上調(diào)10倍以上，上調(diào)5一10倍，下調(diào)5一10倍和 下調(diào)10倍以上斑點。 (3)選取8個差異點作質譜測定，選取原則是:可重復，非邊緣化，斑點 清楚，匹配關系肯定，肉眼可見。所獲質譜用Peptldent，Masoot，MS一Fit三個 不同的查詢軟件搜索蛋白質序列數(shù)據(jù)庫。搜索結果為同一蛋白時，再綜合 表觀分子量、等電點判定結果。 實驗結果 1.維甲酸實驗組可見包括馬蹄內(nèi)翻足樣畸形在內(nèi)的多種畸形。畸形 發(fā)生率隨劑量增高而增加。135m歲kg組馬蹄內(nèi)翻足樣畸形發(fā)生率為 60.98%，14Dm留kg組發(fā)生率為68.18%。140m擴kg組發(fā)生馬蹄內(nèi)翻足樣 畸形的胎鼠多數(shù)伴發(fā)其它畸形且表現(xiàn)胚胎毒性。135m留kg組單純馬蹄內(nèi) 翻足樣畸形的發(fā)生率最高，達29.27%，胚胎毒性輕微。120m擴kg組與130 m擴kg組馬蹄內(nèi)翻足畸形及其它畸形發(fā)生率很低。 足大體組織切片顯示，典型畸形足與對照相比在橫截面上足前部明顯 向內(nèi)傾斜，距骨變小呈楔形位于跟骨后內(nèi)側;距骨前后軸縮短，，呈菱形;脛骨 和附骨趨向同一解剖面;距骨、跟骨前部均向內(nèi)偏。脛骨躁趨向于距骨的掌 面。排骨跺位于較后的位置，甚者與跟骨形成
【圖文】：

圖1Wistar大鼠孕21天胚胎肌肉ZD電泳圖，等電聚焦用17cmpH3一IOIPG膠條，上樣量o.smg蛋白，上樣體積350ul，二向12%SDs聚丙烯酞胺凝膠電泳，20火Zoem，銀染.

2wistar大鼠孕21天胚胎肌肉ZD電泳圖等電聚焦用17cmpH3一10IPG膠條，上量0.smg蛋白，上樣體積350ul，二向12%SDS聚丙烯酞胺凝膠電泳，ZOx20cm考瑪斯亮藍染色。A，PDQuest處理高斯圖;B，示Pl值與分子量分布。
【學位授予單位】：中國醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2004
【分類號】：R-332

【參考文獻】

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本文編號：2671978