【摘要】：降鈣素基因相關(guān)肽(Calcitonin gene-related peptide，CGRP)被證實可以促進成骨細(xì)胞的增殖和分化活性，已知的CGRP信號調(diào)控通路包括了：胞內(nèi)鈣離子通道(Ca2+)、環(huán)磷酸腺苷(cAMP)、蛋白激酶(PKC)、絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)、胞外信號調(diào)節(jié)激酶(ERK)等。大量實驗證實，骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)也同樣擁有誘導(dǎo)成骨的能力。骨髓基質(zhì)細(xì)胞在有BMP-2參與的基礎(chǔ)上，通過旁分泌和自分泌作用，在細(xì)胞和細(xì)胞間質(zhì)傳導(dǎo)信息，刺激DNA的合成和細(xì)胞的復(fù)制，促進成骨細(xì)胞前體的增殖，誘導(dǎo)未分化間充質(zhì)細(xì)胞不可逆地分化為軟骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞，提高干細(xì)胞的成骨表型和成骨能力，增強堿性磷酸酶(Alkaline phosphatase，ALP)的活性，促進細(xì)胞間的粘附和成骨細(xì)胞標(biāo)記基因的表達。目前已知的BMP對成骨細(xì)胞的信號傳導(dǎo)主要包括有Smad，P38MAPK通路。 目前的研究發(fā)現(xiàn)：BMP-2，4，6可以促進神經(jīng)分泌CGRP，CGRP在體外促進牙髓細(xì)胞分泌BMP-2，BMP-2體內(nèi)異位誘導(dǎo)成骨組織中CGRP的神經(jīng)可以再生分布，BMP-2在腹腔注射CGRP的大鼠脛骨骨折愈合的骨痂中高表達，CGRP在體外協(xié)同增加BMP-2誘導(dǎo)成骨細(xì)胞增殖的能力。這些研究結(jié)果提示：CGRP可以誘導(dǎo)骨組織中BMP-2的表達增加，但兩者之間相互作用的信號通路機制目前尚不清楚，因此推測CGRP的促成骨作用可能與BMP-2的表達有相關(guān)性。本實驗將對CGRP促成骨細(xì)胞增殖、分化作用中BMP信號通路所發(fā)揮的作用；CGRP促成骨細(xì)胞BMP-2表達的影響及其機制等進行研究。 方法 1．細(xì)胞培養(yǎng)：人骨肉瘤細(xì)胞(MG63)細(xì)胞株(中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院)接種于培養(yǎng)瓶(100ml)中傳代培養(yǎng)(5×106個/cm~2)，培養(yǎng)基為RPMI1640(含10%FBS)，放置于5%CO2孵箱中37°C孵育72h傳代，傳代至6-7代時使用。 2．CGRP對MG63細(xì)胞增殖和分化的調(diào)控作用： 2.1MG63細(xì)胞增殖：MTT法檢測CGRP對MG63細(xì)胞增殖的調(diào)控作用；流式細(xì)胞儀檢測CGRP對MG63細(xì)胞增殖周期的調(diào)控。設(shè)定量效作用的濃度為(10~( 10)-10~( 7)M)，時效作用為(24-72h)。 2.2MG63細(xì)胞分化：PNPP偶氮法檢測CGRP對MG63細(xì)胞ALP染色的調(diào)控作用；Western blot檢測CGRP對MG63細(xì)胞堿性磷酸酶(ALP)、Ⅰ型膠原(CollagenⅠ)、骨鈣素(OCN)表達的調(diào)控作用。設(shè)定量效作用的濃度為(10~(-10)-10~(-7)M)，時效作用為(24-72h)。免疫熒光染色檢測10-8M CGRP對MG63(48h)ALP表達的作用。 3．CGRP對MG63細(xì)胞增殖、分化調(diào)控中BMP信號通路的作用： 3.1分組：10-8M CGRP；10-8M CGRP+100ng/ml Noggin；100ng/ml Noggin；空白對照組，作用時間為48h。 3.2MG63細(xì)胞增殖影響：流式細(xì)胞儀檢測MG63細(xì)胞增殖周期。 3.3MG63細(xì)胞分化影響：免疫熒光染色檢測MG63細(xì)胞的ALP表達；Western blot檢測MG63細(xì)胞的ALP，ColIaⅠ和OCN蛋白表達。 4．CGRP對MG63細(xì)胞表達BMP-2的調(diào)控作用： 4.1RT-PCR檢測CGRP對MG63細(xì)胞表達BMP-2mRNA的調(diào)控作用：設(shè)定量效作用的濃度為(10~(-10)-10~(-7)M)，時效作用為(1-48h)。 4.2CGRP促進MG63細(xì)胞表達BMP-2中Noggin的作用： 分組：10-8M CGRP；10-8M CGRP+100ng/ml Noggin；100ng/ml Noggin；空白對照組，作用時間48h。 RT-PCR檢測MG63細(xì)胞BMP-2mRNA的表達；Western blot檢測MG63細(xì)胞BMP-2蛋白的表達。 5．CGRP促進MG63細(xì)胞表達BMP-2的機制： 5.1分組：10-8M CGRP、10-8M CGRP+5μM H-89、5μM H-89、空白對照組，作用時間48h。 5.2免疫檢測試劑盒檢測MG63細(xì)胞cAMP表達；RT-PCR檢測MG63細(xì)胞BMP-2mRNA表達；Western blot檢測MG63細(xì)胞BMP-2、環(huán)磷酸腺苷反應(yīng)元件結(jié)合蛋白(cAMPresponse element binding protein， CREB)、磷酸化環(huán)磷酸腺苷反應(yīng)元件結(jié)合蛋白(Phosphorylated Camp Response Element Binding Protein，pCREB)的表達。 6．統(tǒng)計分析： 所有數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，應(yīng)用Dunnett，s檢驗中的t檢驗和方差分析，進行統(tǒng)計分析，分別設(shè)定p0.05以及p0.01表明有顯著性差異和差異非常顯著。 結(jié)果 1．CGRP對MG63細(xì)胞增殖、分化的調(diào)控作用： 1.1MG63細(xì)胞增殖：MTT法檢測發(fā)現(xiàn)CGRP加入MG63細(xì)胞培養(yǎng)基中24-72h的時間段中，CGRP各濃度組的細(xì)胞數(shù)均顯著高于空白對照組(P0.05)，其中以10-8MCGRP濃度組最為明顯(P0.05)；流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞增殖周期發(fā)現(xiàn)不同濃度的CGRP都加速了細(xì)胞周期循環(huán)，但是以48h10-8M組最為明顯(P0.05)，48h以后有下降趨勢。 1.2MG63細(xì)胞分化：PNPP偶氮法檢測發(fā)現(xiàn)各濃度組的CGRP促進MG63細(xì)胞的ALP表達量均高于空白對照組，其中以72h10-8M組最為明顯(P0.05)，時效對比中發(fā)現(xiàn)各濃度組細(xì)胞的ALP表達量在72h較48h增加不明顯(P＞0.05)；蛋白定量分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)各實驗組的ALP，ColIaⅠ和OCN蛋白表達量均高于空白對照組(P0.05)，其中以48h10-8M組最為明顯(P0.05)；免疫熒光染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)48h10-8M組熒光數(shù)目較空白對照組多。 2．CGRP對MG63細(xì)胞增殖、分化調(diào)控中BMP信號通路的作用： 2.1MG63細(xì)胞增殖：流式細(xì)胞儀檢測發(fā)現(xiàn)CGRP組和CGRP+Noggin組的S+G2期細(xì)胞的數(shù)目高于空白對照組(p0.05)，但是CGRP組和CGRP+Noggin組之間沒有明顯差異。 2.2MG63細(xì)胞分化：Wstern-blot檢測CGRP組ALP，ColIaⅠ和OCN蛋白的表達量高于空白對照組(p0.05)；CGRP+Noggin組低于CGRP組(p0.05)。 3．CGRP對MG63細(xì)胞表達BMP-2的調(diào)控作用： 3.1PCR檢測發(fā)現(xiàn)8-24小時內(nèi)只有10-8M、10-7M組可以檢測到BMP-2mRNA的表達，且10-7M組明顯高于10-8M組(p0.01)；48h10-9M組可檢測到BMP-2mRNA表達，但明顯低于48h10-8M、48h10-7M兩組(p0.01)。 3.210-8M CGRP作用48h，MG63細(xì)胞BMP-2mRNA和蛋白的表達量，CGRP組高于空白對照組和Noggin組(P0.01)，CGRP+Noggin組與CGRP組無差異。 4．CGRP促進MG63細(xì)胞表達BMP-2的機制： 4.1MG63細(xì)胞cAMP含量檢測發(fā)現(xiàn)，CGRP組和CGRP+H-89組均高于空白對照組(P0.01)，但是前兩組之間無顯著差異。 4.2CGRP、CGRP+H-89、H-89和空白對照組的CREB表達量無顯著差異。 4.3CGRP組的pCREB蛋白表達量高于空白對照組(P0.01)，，但是CGRP+H-89組明顯低于CGRP組(P0.01)。 4.4CGRP組的BMP-2mRNA和蛋白表達量高于空白對照組(P0.01)，但是CGRP+H-89組明顯低于CGRP組(P0.01)。 結(jié)論 1．CGRP促進MG63細(xì)胞的增殖與分化，并且具有時間以及劑量依賴性，優(yōu)勢濃度為10-8M，優(yōu)勢時段為48h。 2．CGRP可能通過BMP-2途徑促進MG63細(xì)胞的分化，而不通過BMP-2途徑促進MG63細(xì)胞的增殖。 3．CGRP促進MG63細(xì)胞表達BMP-2，并且具有時間以及劑量依賴性，優(yōu)勢濃度為10-7M，優(yōu)勢時段為48h。 4．CGRP促進MG63細(xì)胞BMP-2表達的可能機制是：通過CGRP促進cAMP合成，從而促進CREB磷酸化，進而促進BMP-2轉(zhuǎn)錄。
【圖文】：

.1.3.21 MTT 溶液g/L MTT 0.5gS 100ml.2 方法.2.1 MG63 細(xì)胞培養(yǎng)及 CGRP 處理骨肉瘤細(xì)胞 MG63 細(xì)胞株(中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院)以 5×于 100ml 培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)傳代，加入 RPMI 1640 培養(yǎng)基(含 10%FBS)，中 37°C 孵育 72h 傳代。傳代至 6-7 代時使用(圖 1-1)。開始實驗前40 培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞 24h。實驗加入 CGRP 濃度分別 10-10，10-9，10-8CGRP 后 24h，48h，72h 后收獲細(xì)胞；空白對照組細(xì)胞加 1ml RPM)，37℃，5% CO2，培養(yǎng) 24h，48h，72h 作為對照。

2.3 結(jié) 果2.3.1 MG63細(xì)胞增殖的檢測結(jié)果(MTT比色法)本實驗中CGRP具有明顯的促進MG63細(xì)胞增殖的作用(圖1-2、1-3)。在CGRP作用
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R363

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本文編號：2670519