【摘要】：盡管反義核酸、Ribozyme、DNA enzyme以及雙鏈RNA干涉小分子與mRNA分子在一級結構上嚴格按Watson-Crick堿基匹配原則互補配對發(fā)揮作用，然而能有效結合發(fā)揮作用的卻是那些接近mRNA分子高度折疊結構的“靶點”的反義序列。本工作的主要目標是建立mRNA靶點的篩選方法，運用反義設計技術進行基因治療和基因功能研究。 首先，采用單鏈寡核苷酸隨機序列文庫，首次應用3’末端固定方法使mRNA在液相中的自然狀態(tài)下與其進行雜交，通過洗脫、篩選，獲得mRNA的結合文庫序列，闡明mRNA全部結構靶點，建立了一種新的mRNA靶點篩選的分子生物學方法RASS(RNA accessible sites screening)。 其次，用RASS方法和文獻報道的MAST(mRNA accessible sites tagging)技術同時對模型基因--綠色熒光蛋白GFP的mRNA進行了靶點篩選，應用RASS獲得GFP mRNA上3個結合靶點1，2，4，采用MAST方法獲得了1，2，3和4等4個靶點，其中1、2、4與RASS的3個靶點完全相同。體外，4個靶點中1、2、4號靶點的反義核酸有效，2和4號的結合效果最好；細胞內(nèi)1、2、4號的反義核酸明顯而特異抑制了熒光蛋白表達，2號反義核酸突變2個堿基的對照組在體外體內(nèi)均喪失了作用效果。 對2號靶點設計了向5’和向3’移位的多條反義核酸(分別錯位4個和8個堿基的反義核酸A2-8、A2-4、A2+4、A2+8)，實驗表明，只有2號靶點反義核酸的作用效果最好，據(jù)RASS所設計合成的反義核酸序列準確，是最佳設計的反義核酸序列。 10-23DNA enzyme的體內(nèi)體外作用活性和反義核酸組完全相同，四個靶點的2和4號靶點的10-23DNA enzyme切割效果最好，1號其次，3號效果不佳。細胞內(nèi)抑制效果與之相同。10-23DNA enzyme的體外體內(nèi)作用活性正確反映了反義核酸結合有效性，提出：10-23DNA enzyme可以作為體外評價mRNA結構靶點的工具。 博}一學位論文 論文摘要 設計l小23DNA enzyme對照組時，如果突變錯配的堿基位于切割位置的左右堿基使 10一23DNA enzyme突環(huán)結合能力降低，體外喪失了對mRNA的降解能力，但在細胞內(nèi)仍 抑制GFP基因表達，10一23DNA enzyme的結合臂序列發(fā)揮了反義核酸作用。10一23DNA enzyme對照組突變10一23DNA en即me兩個結合臂中間堿基，使10一23DNA enzyme保留突 環(huán)結合能力、降低兩臂結合能力，則喪失了對mRNA的降解能力，細胞內(nèi)也喪失了抑制 GFP基因表達。 !o一23DNA enzyme自身具切割mRNA的活性，用實驗證明了10一23DNA enzyme的側 翼結合臂序列與RNA互補結合以后能發(fā)揮誘導RNaseH的酶促降解mRNA作用，認為 10一23DNA enzyme能產(chǎn)生比反以核酸更理想的基因抑制效果。證明DNA enzyme在細胞 內(nèi)具有雙重活性，比反義核酸有更好的應用潛力。 第三，將RAsS方法和MAsT方法、計算機軟件RNAstructure3.71模擬方法對GFP的 靶點，MAsT方法和RNAstructure3 .71模擬方法對小鼠Fas基因，兔p一globin基因片段的靶 點進行了比較。 RNAstructure3.71模擬長度較短的基因靶點正確。據(jù)MAST技術獲得的兔 (oryetolagus eunieulus)p一globin基因mRNA(屬于122nt的小基因片段)的靶點2個，和計 算機軟件RNAstructure3.71模擬分析的位點，也和寡核普酸微陣列雜交技術篩選獲得的 靶點結果(NatazieM，1 997)完全一致。 已經(jīng)證明綠色熒光蛋白(GFP) mRNA4個結構靶點中2，4號是高效結合靶點，MAsT 技術獲得了4號，但是它把2號靶點當作了低頻率、低效靶點從而忽略了2號靶點，得到 了3號無效靶點;RASS得到的靶點均有效，可能因為RNA“隨機”標記技術導致了MAST 對有效靶點的忽視;而R了、55采用末端標記，能夠獲得全部有效靶點。 RNAstrueture3.71軟件分析的靶點與GFP的4個靶點中有3個相同，約有50%一60%能 被預測得到。MAST篩選了1 .skb小鼠Fas基因2個靶點(1，2)，只有一個最有可能被 RNAstructure軟件預測分析得到(靶點2)，尚有許多其它可能的靶點。軟件分析模擬推薦 的結構靶點較多，隨著基因長度增加計算機軟件分析確認靶點的難度增大，預測的靶點 需要實驗驗證，但是它對實驗篩選靶點、設計反義核酸有輔助價值。RAss和MAsT等 實驗篩選方法能篩選各種長度基因mRNA的靶點，比軟件預測具有簡單、快捷和有效的 優(yōu)，點。 博卜‘學位論義 論文摘要 第四，由于RASS和MAST方法在應用中，需要一條一條地測定成百條序列，1次測 序反應獲得1條文庫小片段序列，測定過程繁雜，消耗大量人力和物力，不利于其在普 通實驗室推廣應用。本研究自行建立了兩個專利方法，其一采用小序列酶切、連接、克 隆測序，其二通過設計搭橋引物、擴增達到連接而完成連接測序的目的。文庫小片段序 列通過連接進行測序，，1次測序反應可以獲得8至20條文庫小片段序列，其費用約為原始 方法的二十分之一至八分之一。此方法快速而經(jīng)濟，能滿足普通實驗室應用凡ASS， MAS’I’篩選靶點的需求。
【圖文】：

圖1.RASS技術篩選靶點原理簡圖2圖3圖4圖6基因的PCR擴增1.6kbP;圖3.IA6基因轉錄得到的cRNA8oobp擴增產(chǎn)物6ObP;圖5.文庫序列的擴增產(chǎn)物插入T載體的陽性DNA標準分子量采用TAKARA公司的DLZoo0Marker分別為:。)

博卜學位論文第二部分結果GFP基因轉錄模板DNA和eRNAPCR擴增得到75obp大小的GFp基因轉錄模板DNA和cRNA(圖2，3)，產(chǎn)物兩端分別被引入了T3啟動子序列和PolyA序列。以此產(chǎn)物為模板，在T3RNApolymerase的作用下，37oCl.sh后可獲得優(yōu)質(zhì)的RNA(圖3)，此RNA產(chǎn)物的末端為PolyA。
【學位授予單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2004
【分類號】：R346

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本文編號：2657223