發(fā)布時間：2020-05-09 10:28

【摘要】：目的： 內(nèi)皮損傷是動脈粥樣硬化、心肌梗死、經(jīng)皮冠狀動脈介入治療術(shù)后支架內(nèi)再狹窄、下肢動脈硬化閉塞癥（PAD）、休克等各種血栓性疾病的始動病因。促進內(nèi)皮細胞（EC）的完整性，維持其正常功能，將為此類疾病提供新的防治手段。本研究探討了一個新近發(fā)現(xiàn)的調(diào)控細胞轉(zhuǎn)錄的基因——E1A激活基因阻遏子（CREG）調(diào)控人臍靜脈內(nèi)皮細胞（HUVEC）周期的作用和機制，并在小鼠下肢缺血模型中初步探討了其對血管新生的影響。 方法： （1）以綠色熒光蛋白（GFP）腺病毒感染HUVEC作為對照，應(yīng)用CREG腺病毒使HUVEC過表達CREG，以細胞計數(shù)、BrdU摻入實驗、流式細胞術(shù)（FCM）檢測CREG對HUVEC增殖的影響，Western blot檢測HUVEC中CREG、信號通路、細胞周期蛋白（Cyclins）及細胞周期蛋白依賴性激酶（CDKs）的表達，RT-PCR檢測Cyclins在轉(zhuǎn)錄水平上的表達差異。（2）以表達短發(fā)卡RNA （shRNA）序列的陰性空載體為對照，將CREG表達沉默的shRNA載體轉(zhuǎn)染至逆轉(zhuǎn)錄病毒，產(chǎn)生病毒后感染HUVEC，經(jīng)嘌呤霉素篩選，得到CREG表達下調(diào)的HUVEC；應(yīng)用細胞計數(shù)、BrdU摻入實驗、FCM檢測從功能缺失角度驗證CREG下調(diào)對HUVEC增殖的影響。（3）根據(jù)信號通路Western blot結(jié)果的提示，應(yīng)用信號通路阻斷劑阻斷可被CREG明顯影響的信號通路，以BrdU摻入實驗及FCM檢測細胞增殖并確定CREG發(fā)揮生物學(xué)作用的通路，Westernblot檢測蛋白表達及信號通路蛋白及Cyclins的表達，確定CREG相關(guān)的信號通路及Cyclins。（4）在腺病毒感染造成CREG過表達的HUVEC中使用血管內(nèi)皮生長因子中和抗體（VEGF NA）阻斷VEGF的作用；在CREG被干擾造成其表達下調(diào)的HUVEC中添加重組人血管內(nèi)皮生長因子（rhVEGF165），以細胞計數(shù)、BrdU摻入試驗、FCM檢測細胞增殖，同時以Western blot檢測信號通路以及Cyclins的表達，確定血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）是否參與了CREG調(diào)控HUVEC增殖及Cyclins表達的作用。（5）以正常的以及感染GFP腺病毒的HUVEC作為對照，應(yīng)用體外及小鼠在體matrigel血管生成實驗檢測HUVEC感染CERG腺病毒后對血管生成的影響；制作小鼠下肢缺血模型后，以PBS、GFP腺病毒做為對照，應(yīng)用CREG腺病毒感染局部缺血肌肉組織，觀測術(shù)肢體溫、自體截肢率，以病理切片觀測肌纖維形態(tài)改變，應(yīng)用血流灌注成像儀檢測術(shù)肢/健肢灌注比，檢測CREG對小鼠下肢缺血的治療作用以及對血管新生的影響。 結(jié)果： （1）與對照組相比，HUVEC經(jīng)腺病毒感染過表達CREG后，細胞計數(shù)增多，BrdU摻入實驗中BrdU陽性細胞百分比增多，F(xiàn)CM分析提示S+G2期占全部細胞比例增多；而在shRNA導(dǎo)致CREG表達下調(diào)后，與對照組相比，發(fā)現(xiàn)細胞計數(shù)減少，BrdU陽性細胞百分比減少，F(xiàn)CM分析可見S+G2期占全部細胞比例減少。（2）Wstern blot提示：與對照組相比，CREG可使ERK、PI3K/Akt信號通路激活，Cyclin E表達增多，RT-PCR發(fā)現(xiàn)CREG可在轉(zhuǎn)錄水平影響Cyclin E的表達。（3）信號通路阻斷劑添加后，BrdU摻入實驗及FCM檢測提示：盡管PI3K/Akt、ERK信號通路都可影響CREG調(diào)控的HUVEC增殖，但ERK通路特異性的介導(dǎo)了CREG對HUVEC增殖的調(diào)控，，Western blot檢測也證實了ERK特異性的介導(dǎo)了CREG對Cyclin E的調(diào)控。（4）體外及在體matrigel血管生成實驗發(fā)現(xiàn)CREG過表達可使毛細血管密度明顯增多；小鼠下肢缺血模型制作成功后，以腺病毒感染缺血區(qū)肌肉組織，經(jīng)檢測發(fā)現(xiàn)過表達CREG的腺病毒感染組與PBS組以及GFP腺病毒相比，術(shù)肢體溫升高、自體截肢率降低、病理切片提示肌纖維萎縮程度明顯減輕，血流灌注成像儀檢測結(jié)果提示與對照組相比，CREG過表達組術(shù)肢/健肢灌注比升高。 結(jié)論： （1）CREG可促進體外培養(yǎng)HUVEC的增殖；（2）ERK/Cyclin E通路介導(dǎo)了CREG對HUVEC增殖的調(diào)控作用；（3）CREG過表達能促進小鼠缺血下肢的血管新生。本研究為PAD的治療提供了一個新的靶點，也為CREG在缺血性心肌病、經(jīng)皮冠脈內(nèi)介入治療術(shù)后支架內(nèi)再狹窄及遲發(fā)性血栓的防治中的應(yīng)用提供了新的證據(jù)。
【圖文】：

組以及 HUVEC 組相比有 CREG 表達明顯增多，而對照組（HUVEC-GFP 組）與正常組（HUVEC 組）相比無明顯差異（圖 2-1B）。圖2-1 腺病毒感染HUVEC的效率以及Western blot檢測CREG表達情況A. HUVEC-AdCREG組以及HUVEC-GFP組經(jīng)相應(yīng)腺病毒感染72h后感染率均在90%以上。a.光鏡下HUVEC-AdGFP組細胞圖像；b.熒光顯微鏡下HUVEC-AdGFP組細胞發(fā)出熒光，感染率90%以上；c.光鏡下HUVEC-AdCREG組細胞圖像；d.熒光顯微鏡下HUVEC-AdCREG組細胞發(fā)出熒光，感染率90%以上。B. Western blot檢測各組細胞CREG表達情況。上圖：Western blot 提示HUVEC-AdCREG組細胞CREG表達明顯增多；下圖：灰度半定量分析（以β-tubulin作為內(nèi)參，CREG/β-tubulin灰度比作為數(shù)值進行比較）提示HUVEC組（0.62±0.04）與HUVEC-AdGFP組（0.58±0.06）之間CREG的表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義（NS: no significance），HUVEC-AdCREG組（3.60±0.37）與HUVEC、HUVEC-AdGFP間相比差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（**p＜0.01, n=3）。2）CREG過表達可促進原代培養(yǎng)的HUVEC的增殖。HUVEC經(jīng)CREG腺病毒感染后，經(jīng)細胞計數(shù)、BrdU摻入試驗及FCM檢測分析，與正常HUVEC及HUVEC-AdGFP對照組相比，HUVEC-AdCREG組在培養(yǎng)第3d細胞數(shù)量明顯增多（162.7±10.5×105vs 130.7±6.7×105vs 135.7±6.0×105

第三軍醫(yī)大學(xué)博士學(xué)位論文25胞比例顯著增高（64.3±5.1% vs 49.3±5.1% vs 51.7±6.8%，圖2-2B）、S+G2期細胞百分比顯著增高（65.0±2.6% vs 43.3±1.5% vs 44.0±1.0%，圖2-2C），差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，HUVEC組與HUVEC-AdGFP組相比無統(tǒng)計學(xué)意義。這些結(jié)果表明CREG過表達可促進HUVEC的增殖。圖2-2 細胞計數(shù)、BrdU摻入實驗、FCM分析檢測CREG過表達對HUVEC增殖的影響A．細胞計數(shù)：三組細胞各取2×105連續(xù)培養(yǎng)72h，每24h計數(shù)，結(jié)果經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析提示：HUVEC-AdCREG組（162.7±10.5×105）與HUVEC（130.7±6.7×105）、HUVEC-AdGFP（135.7±6.0×105）組相比，生長至72h時計數(shù)結(jié)果差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（** p＜0.01, n=3），HUVEC與HUVEC-AdGFP組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義。B．BrdU摻入試驗：結(jié)果提示BrdU陽性細胞百分比在HUVEC-AdCREG組（64.3±5.1%）與HUVEC組（49.3±5.1%）、HUVEC-AdGFP（51.7±6.8%）組相比差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（* p＜0.05,n=3 ），HUVEC與HUVEC-AdGFP組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義（NS: no significance）。C．FCM檢測：HUVEC-AdCREG組S+G2期細胞百分比（65.0±2.6%）與HUVEC（43.3±1.5%）、HUVEC-AdGFP（44.0±1.0%）組相比差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（*** p＜0.001, n=3）
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R54;R-332

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 關(guān)德明,余秀蘭,焦鶴齡;動脈粥樣硬化形成機制研究的新動態(tài)[J];哈爾濱醫(yī)科大學(xué)學(xué)報;2001年03期

2 張建江;易著文;;血管內(nèi)皮細胞損傷及修復(fù)的研究進展[J];臨床心身疾病雜志;2007年02期

3 韓雅玲,康建,張劍,李少華;對去血清后HITASY細胞分子表達及表型分析[J];生物化學(xué)與生物物理進展;2003年06期

4 韓雅玲,閆承慧,劉海偉,胡葉,康建,王效增,李少華;E1A激活基因阻遏子過表達誘導(dǎo)體外培養(yǎng)大鼠平滑肌細胞分化[J];生物化學(xué)與生物物理進展;2004年12期

5 韓雅玲;徐紅梅;閆承慧;胡葉;康建;劉海偉;;RhoA和血清反應(yīng)因子(SRF)介導(dǎo)E1A激活基因阻遏子誘導(dǎo)人血管平滑肌細胞分化[J];生物化學(xué)與生物物理進展;2006年05期

6 韓雅玲;趙昕;閆承慧;康建;張效林;鄧捷;徐紅梅;劉海偉;;轉(zhuǎn)錄因子E2F1抑制CREG表達調(diào)控體外培養(yǎng)的人血管平滑肌細胞分化[J];生物化學(xué)與生物物理進展;2007年05期

7 吳光哲;閆承慧;韓雅玲;陶杰;鄧捷;田孝祥;張保海;王濤;康建;張效林;;E1A激活基因阻遏子(CREG)過表達通過抑制p38/JNK信號分子活化對抗人血管平滑肌細胞凋亡[J];生物化學(xué)與生物物理進展;2009年12期

8 韓雅玲;徐紅梅;鄧捷;胡葉;康建;劉海偉;閆承慧;;E1A激活基因阻遏子過表達抑制體外人血管平滑肌細胞凋亡[J];生理學(xué)報;2006年04期

9 楊曉燕;;內(nèi)皮細胞的異質(zhì)性與動脈粥樣硬化[J];西南國防醫(yī)藥;2007年03期

10 韓雅玲;鄧捷;梁明;康建;劉海偉;徐紅梅;閆承慧;;逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的E1A激活基因阻遏子抑制大鼠頸動脈球囊損傷后新生內(nèi)膜形成[J];中國病理生理雜志;2007年10期

本文編號：2656002