【摘要】：化學治療（chemotherapy）是腫瘤主要治療方法之一。在臨床應用中可能有2個問題影響療效：化療藥物的毒副作用如骨髓抑制和心肌毒性等以及腫瘤治療過程中發(fā)生的耐藥現(xiàn)象。近年來國內外學者對P-糖蛋白等親脂性藥物轉運體蛋白的表達，活性以及藥物調節(jié)進行了大量研究，為克服腫瘤化療藥物毒性及耐受問題提供了可能性。 P糖蛋白（p-gp）為跨膜糖蛋白，屬于ATP結合匣轉運體超家族。編碼基因稱mdr1。完整p-gp分子含1246個氨基酸殘基；N端和C端構成跨膜-胞外區(qū)（分別6次跨膜）；肽鏈中部的氨基酸序列構成ATP結合功能區(qū)，可結合及水解ATP，為逆濃度梯度轉運底物的跨膜運輸提供能量。幾乎全部涉及腫瘤細胞與p-gp表達的文獻都指出：通過p-gp轉運的底物具有結構和藥理作用多樣性的特點；然而近年已有研究表明p-gp對親脂性分子選擇性結合，結合位點可能位于跨膜區(qū)。而其轉運底物也不僅限于抗腫瘤藥物，異博定（VRPL）、類固醇等非極性分子都能與p-gp結合而被其轉運。 在多種組織細胞中，p-gp組成型表達。這表明p-gp在生理狀態(tài)下也承擔物質轉運過程。應激性刺激等細胞內外環(huán)境的改變也可成為p-gp表達的誘導因素。腫瘤細胞長期接受化療藥物刺激，p-gp的轉錄和翻譯明顯提高，這是發(fā)生所謂多藥耐受（MDR）的原因。此外，細胞內[Ca2+]增加也是誘導包括mdr-1在內的多個活化基因表達的信號。毒毛旋花子甙K（STPK）通過抑制Na+/K+ATP酶活性而升高細胞內[Ca2+]，可刺激mdr1的轉錄。 本論文的研究內容有：（1）以K562、MCF-7和SMM7721細胞作為反 WP=80 應細胞，分析VRPL和STPK的細胞增殖調節(jié)作用以及對p-gp活性和表達的影響；（2）通過STPK誘導mdr-1表達，克隆mdr-1編碼序列并構建基因疫苗；（3）以mdr1基因疫苗免疫小鼠，觀察特異性血清抗體滴度以及心、肝、腎組織的形態(tài)性。為p-gp生物學活性研究的深入以及p-gp的調節(jié)性藥物在臨床上用于糾正p-gp相關的毒性和耐藥性奠定基礎。 STPK和VRPL對K562細胞化療藥物敏感性的調節(jié)作用 采用MTT標記細胞增殖反應，觀察STPK和VRPL對傳代腫瘤細胞系體外增殖的影響以及對柔紅霉素（ADR）敏感性的調節(jié)作用。 本研究對傳統(tǒng)MTT分析法做了兩點修改：其一，細胞培養(yǎng)中加入MTT后離心棄去培養(yǎng)的上清部分；其二，僅加入異丙醇溶解MTT代謝后生成的甲佲 沉淀，實驗結果顯示第一項修改可以大大減低由于培養(yǎng)液顏色改變產生的非特異性背景；第一和第二項修改則明顯提高甲佲 的溶解性。增加了MTT試驗的度量區(qū)間（OD570值域隨細胞密度不同達到0~2.0），因此增加了該方法測量細胞增殖的敏感性。細胞密度的可測量區(qū)間2×104~20×104。 1、STPK和VPRL的細胞毒性：在K562、MCF-7和SMMC 7721 3種傳代細胞系的培養(yǎng)中分別加入0.022~1.4μg/ml STPK或0.25~10μg/ml VRPL，培養(yǎng)時間48hrs，然后加入MTT，檢測細胞的增殖反應是否因不同濃度藥物的存在而表現(xiàn)濃度相關的抑制作用或稱細胞毒作用。STPK 0.022~0.35μg/ml，K562細胞的增殖無明顯改變；兩種貼壁生長的傳代細胞系在0.088~0.35μg/ml濃度范圍由細胞增殖表現(xiàn)不同程度抑制（30~40%），但無藥物濃度相關性。鏡下細胞貼壁明顯減少。STPK 0.70μg/ml，K562細胞增殖抑制率達29.6%，MCF-7和SMMC7721則分別為60.6%和52.3%；而藥物濃度升至1.4μg/ml時，相應增至約70%。這說明STPK在0.70μg/ml以上時，3種細胞呈現(xiàn)細胞毒反應。VRPL 0.25~2.5μg/ml，K562細胞增殖與對照（藥物濃度=0）相比無變化，但MCF-7和SSMC7721的OD570下降明顯，，藥物濃度超過1μg/ml，細胞增殖超過50%。因此得出結論：這兩種藥物對非粘附生長的傳代細胞體外增殖影響較小，但對粘附生長的腫瘤細 WP=81 胞，則由于干擾細胞的貼壁而對增殖產生較大的抑制作用。 2、STPK和VRPL改變K562細胞對ADR的敏感性：ADR是白血病化療治療的常用藥物，在K562細胞培養(yǎng)中加入倍比稀釋的ADR，最大和最小濃度分別是4μg/ml和0.0625μg/ml。6復孔平行測量培養(yǎng)24小時的細胞增殖。對實驗結果，采用統(tǒng)計學分析系統(tǒng)軟件包（Statistic Analyses System, SAS）進行藥物濃度單因素線性相關的F檢驗。OD570測量顯示：ADR 2-4μg/ml加入1×105個細胞的培養(yǎng)中，測量值與未加細胞的空白對照相同（0.07±0.04）。ADR 0.065μg/ml對K562細胞增殖無影響，抑制率（％）等于0。ADR 0.0625—2μg/ml，OD570和細胞增殖抑制率與藥物濃度的自然對數(shù)之間線性相關（r=0.987, CN=9.728, F=422.7）。 在分析ADR敏感性之前，K562細胞培養(yǎng)中加入STPK或VRPL（終濃度分別為0.25和2.5μg/ml），37℃ 5%CO2孵育48hrs。進行ADR敏感性測定。SAS雙因素（對照及兩種藥物3個分組；每組中0~2μg/mlADR 7種藥物濃度）；線性相關的Anova檢驗顯示未加藥物預培養(yǎng)之對照與兩種藥物分別預處理三組間差別明顯：組間平均平方（MS）1.0347，誤差平均平方0.00514，F(xiàn)=201.3；無藥物預培養(yǎng)對照ADR IC50 0.21μg/ml，STPK預培養(yǎng)的K562細胞ADR IC50 0.37μg/ml, VRPL預培養(yǎng)者ADR IC50 0.14μg/ml。結論（1）STPK或VRPL預培養(yǎng)對K562細胞增殖無刺激或抑制作用。（2）STPK預培養(yǎng)降低細胞對ADR的敏感性。（3）VRPL則增加細胞
【學位授予單位】：吉林大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2004
【分類號】：R392

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本文編號：2652631