【摘要】：乙型肝炎病毒(HBV)感染致肝細(xì)胞損傷的機(jī)制，與病毒蛋白和肝細(xì)胞蛋白間的相互作用密切相關(guān)。而乙型肝炎e抗原(HBeAg)是由HBV DNA前-C基因區(qū)編碼的一種非顆粒性的分泌蛋白，隨HBV復(fù)制而增加，臨床上將其作為判斷HBV活動(dòng)性復(fù)制的指標(biāo)之一。因此研究HBeAg與肝細(xì)胞內(nèi)蛋白的相互作用及其機(jī)理，能在一定程度上對(duì)HBV的致病機(jī)制做出解釋，并為尋找有效防治方法提供新線索。 酵母雙雜交技術(shù)是一種研究蛋白-蛋白間相互作用的比較快速、可靠并可大規(guī)模篩選的方法。本實(shí)驗(yàn)所采用酵母雙雜交系統(tǒng)-3，基于兩種單倍體酵母a和α型可以配合形成二倍體，而其中表達(dá)的外源蛋白仍能相互作用的機(jī)理，免去了低效率文庫(kù)質(zhì)粒與誘餌質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染的問題，大大提高了雜交效率；在原技術(shù)基礎(chǔ)上增加了3個(gè)報(bào)告基因，降低了假陽(yáng)性率。我們利用該技術(shù)，根據(jù)中國(guó)HBV流行株序列設(shè)計(jì)引物，，應(yīng)用多聚酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù)，由乙型肝炎患者血清中分離出HBeAg編碼基因序列。經(jīng)測(cè)序鑒定正確后，克隆入酵母表達(dá)載體pGBKT7中構(gòu)建“誘餌”質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞AH109(a型)，表達(dá)后通過Western-blotting鑒定產(chǎn)物活性。隨后與預(yù)轉(zhuǎn)了人肝cDNA文庫(kù)質(zhì)粒pACT2的酵母細(xì)胞Y187(α型)進(jìn)行配合，經(jīng)營(yíng)養(yǎng)缺陷和藍(lán)白斑雙重篩選，獲得了HBeAg結(jié)合蛋白陽(yáng)性克隆245株。提取陽(yáng)性克隆酵母質(zhì)粒，通過Cacl_2穿孔法轉(zhuǎn)化大腸桿菌，接種于氨芐青霉素-LB平板，篩選陽(yáng)性克隆并進(jìn)行序列測(cè)定。測(cè)序結(jié)果在GenBank中進(jìn)行生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)未知功能的新基因有6條，已知蛋白基因35條。 博士論文--一摘要 為進(jìn)一步確證經(jīng)酵母雙雜交技術(shù)篩選出的結(jié)合蛋白與HBeAg在體外也存在 相互作用，我們根據(jù)Genbank中提供的序列信息設(shè)計(jì)引物，以HePGZ細(xì)胞的 mRNA為模板，通過逆轉(zhuǎn)錄一PCR擴(kuò)增出CD81及新基因AK026018的全序列，測(cè) 序鑒定后，經(jīng)相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶消化后，克隆入酵母表達(dá)載體pGADT7，在TNT 網(wǎng)織紅細(xì)胞裂解物中進(jìn)行體外翻譯，摻入同位素3，s，與HBeAg進(jìn)行體外免疫共 沉淀反應(yīng)，經(jīng)SDS一PAGE電泳，一20℃條件下放射自顯影，再次證實(shí)上述蛋白間 結(jié)合作用的可靠性。 在新基因功能的研究方面，我們對(duì)HBeAg結(jié)合蛋白新基因AKO26018進(jìn)行了 初步探討。首先明確了該基因表達(dá)產(chǎn)物的亞細(xì)胞定位，主要位于細(xì)胞漿中;通過 其對(duì)HePGZ細(xì)胞基因表達(dá)譜芯片的研究，推測(cè)該基因可能在細(xì)胞中起著多種復(fù)雜 作用，可通過多種途徑對(duì)許多類型基因表達(dá)進(jìn)行調(diào)控或影響。通過過表達(dá)及SIRNA 抑制實(shí)驗(yàn)證實(shí)，在LZ .2.15細(xì)胞株中HBeAg的分泌量與細(xì)胞內(nèi)AK026018 mRNA 的含量正相關(guān)。同時(shí)CD81過表達(dá)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，隨著cD81 mRNA量的增加HBeAg 的分泌量反而降低。因此推測(cè)AKo26018基因及cD81對(duì)HBeAg的分泌分別有促 進(jìn)及阻礙作用。
【圖文】：

HAg00marks;1:陽(yáng)性結(jié)果;2:陰性結(jié)果;3:空白的鑒定結(jié)果:經(jīng)雙酶切后電泳鑒定(結(jié)果見圖1.3)，可見與插入片的質(zhì)粒片段，將此重組質(zhì)粒命名為T-eAg。利用T7通公布中國(guó)HBV基因型流行株序列比較核酸及氨基酸88%一100%，同時(shí)存在移碼及缺失突變。選取一株%%及100%，且OR衛(wèi)正確的重組T-eAg質(zhì)粒繼續(xù)進(jìn)

1:空質(zhì)粒對(duì)照;2:陰性克隆;3:陽(yáng)性克隆3，3重組結(jié)合域載體鑒定結(jié)果:重組結(jié)合域載體經(jīng)雙酶切后電泳鑒定(結(jié)果見圖1.4)，可見與插入片段大小一致的片段及酶切后的質(zhì)粒片段，將此重組質(zhì)粒命名為pGBKT7一eAg。圖1.4重組質(zhì)粒pGBKT7一eAg的酶切鑒定MI:LalllbdaDN戶口EeoRl+Hind111marks;MZ:DL一2000marks;1，2:陽(yáng)性克隆;3:陰性克隆3.4酵母細(xì)胞轉(zhuǎn)化鑒定結(jié)果:上述重組結(jié)合域載體pGBKT7一eAg用乙酸鏗轉(zhuǎn)化法，轉(zhuǎn)入酵母細(xì)胞AHI的培養(yǎng)，酚一氯仿一異戊醇抽提，純化DNA，應(yīng)用PCR方法進(jìn)行擴(kuò)增，可見與預(yù)期大小一致的片段證明轉(zhuǎn)化成功。
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2004
【分類號(hào)】：R392

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 張萍;CD81與HCV關(guān)系研究進(jìn)展[J];國(guó)外醫(yī)學(xué).病毒學(xué)分冊(cè);2002年04期

2 黃俊琪,郭輝玉;CD81與HCV相關(guān)關(guān)系的研究進(jìn)展[J];國(guó)外醫(yī)學(xué).病毒學(xué)分冊(cè);2000年02期

3 何衛(wèi)平,鄭宇,程云;CD81與免疫應(yīng)答[J];國(guó)外醫(yī)學(xué).免疫學(xué)分冊(cè);2001年03期

4 呂欣;丙型肝炎病毒受體的研究進(jìn)展[J];國(guó)外醫(yī)學(xué).病毒學(xué)分冊(cè);2003年05期

5 李覃,袁育康,范桂香,李彤;CD_(81)與HCV間交互作用的研究進(jìn)展[J];醫(yī)學(xué)綜述;2004年04期

6 徐銘寶,李若冰,雷志勇,黃燕萍,唐紅衛(wèi);乙肝病毒e抗原系統(tǒng)與HBV DNA的相關(guān)性研究[J];武警醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào);1999年03期

7 呂麗萍;丙型肝炎病毒感染細(xì)胞的相關(guān)分子研究進(jìn)展[J];國(guó)外醫(yī)學(xué).流行病學(xué).傳染病學(xué)分冊(cè);2002年05期

8 代志琰;丙型肝炎病毒包膜蛋白E2與CD81關(guān)系的研究進(jìn)展[J];熱帶醫(yī)學(xué)雜志;2003年01期

9 王全楚;HCV通過CD81與靶細(xì)胞結(jié)合[J];實(shí)用肝臟病雜志;1999年02期

10 李克;丙型肝炎病毒與脂質(zhì)系統(tǒng)關(guān)系的研究進(jìn)展[J];國(guó)外醫(yī)學(xué).病毒學(xué)分冊(cè);2002年01期

相關(guān)會(huì)議論文 前10條

1 高銳;;用中醫(yī)整體觀認(rèn)識(shí)e抗原所致的免疫耐受[A];中華中醫(yī)藥學(xué)會(huì)全國(guó)第十四次肝膽病學(xué)術(shù)會(huì)議論文匯編[C];2010年

2 龔瓊模;甘淳;萬義鵬;陳宏義;黎玉冰;;中草藥及復(fù)方抗乙肝病毒S、E抗原的實(shí)驗(yàn)研究與療效——附100例慢性乙型肝炎療效觀察[A];中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)會(huì)第十二次全國(guó)消化系統(tǒng)疾病學(xué)術(shù)研討會(huì)論文匯編[C];2000年

3 李知玉;吳其愷;何清;唐奇遠(yuǎn);段鋼;;慢性HBV感染者血清HBeAg及HBVDNA與肝組織病理分級(jí)分期的關(guān)系[A];中華中醫(yī)藥學(xué)會(huì)全國(guó)第十四次肝膽病學(xué)術(shù)會(huì)議論文匯編[C];2010年

4 代志琰;李剛;徐啟桓;韓曉燕;楊林;陳文思;姚集魯;;丙型肝炎病毒包膜蛋白E2和人CD81的原核表達(dá)及兩者相互關(guān)系的研究[A];全國(guó)寄生蟲學(xué)與熱帶醫(yī)學(xué)學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集[C];2006年

5 鄧家剛;鄭作文;王勤;楊柯;秦華珍;李學(xué)堅(jiān);王春玲;;復(fù)方黃根片等八個(gè)中藥復(fù)方對(duì)2215細(xì)胞HBsAg、HBeAg分泌的影響[A];第四次全國(guó)中西醫(yī)結(jié)合養(yǎng)生學(xué)與康復(fù)醫(yī)學(xué)學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集[C];2004年

6 章友康;;丙型肝炎病毒(HCV)相關(guān)性腎炎[A];中華醫(yī)學(xué)會(huì)腎臟學(xué)分會(huì)2004年年會(huì)暨第二屆全國(guó)中青年腎臟病學(xué)術(shù)會(huì)議專題講座匯編[C];2004年

7 趙惠敏;;美能片改善慢性乙肝患者肝功能體會(huì)[A];2004年浙江省傳染病、肝病學(xué)術(shù)會(huì)議論文匯編[C];2004年

8 湯燕靜;徐

本文編號(hào)：2638551