【摘要】： 漢坦病毒主要引起腎綜合征出血熱（HFRS），對(duì)其結(jié)構(gòu)蛋白的免疫學(xué) 研究表明，病毒糖蛋白（GP）和核蛋白（NP）都與保護(hù)性免疫有關(guān)，其中 囊膜糖蛋白可刺激機(jī)體產(chǎn)生中和抗體，但其免疫原性較弱；NP的免疫原性 最強(qiáng)，它誘生免疫保護(hù)的機(jī)制被認(rèn)為與其可刺激機(jī)體產(chǎn)生細(xì)胞免疫應(yīng)答有 關(guān)。本室前期研究工作證明其抗原位點(diǎn)主要集中在S基因編碼區(qū)5'端約 0.7Kb片段的編碼蛋白上。進(jìn)一步深入研究?jī)煞N結(jié)構(gòu)蛋白的相互關(guān)系并使 之優(yōu)勢(shì)互補(bǔ)，，是HFRS基因工程疫苗的基礎(chǔ)研究中亟待解決的問(wèn)題。 本研究首先將漢坦病毒76-118株M基因G1糖蛋白編碼區(qū)（G1）與 S基因5'端約700bp片段（S0.7）進(jìn)行拼接，構(gòu)建了原核嵌合表達(dá)載體 pGEX-4T-2-G1S0.7和pGEX-4T-2-S0.7G1，分別轉(zhuǎn)化入大腸桿菌中誘導(dǎo)表 達(dá)，均獲得預(yù)期大小的可與抗?jié)h坦病毒NP抗體結(jié)合的融合蛋白，其中 第四軍醫(yī)大學(xué)博士學(xué)位論文 一 GISO刀的表達(dá)產(chǎn)物還可檢測(cè)到微弱的糖蛋白結(jié)合活性，且免疫印跡結(jié)果顯 示其降解明顯少于SO．7GI的表達(dá)產(chǎn)物。 進(jìn)一步構(gòu)建了分別含 SO．7、GI、GISO．7或SO．7GI嵌合基因的重組桿 狀病毒。間接免疫熒光、ELISA和免疫印跡檢測(cè)證明，含SO．7片段的三種 重組桿狀病毒均在昆蟲(chóng)細(xì)胞中表達(dá)出相應(yīng)的活性蛋白。其中GISO．7融合蛋 白可同時(shí)被抗?jié)h坦病毒NP及糖蛋白GI特異性單抗所識(shí)別，免疫印跡結(jié)果 顯示該蛋白分子量與預(yù)期完整融合蛋白大小相一致；而 SO廠GI的表達(dá)產(chǎn)物 僅檢測(cè)到與抗?jié)h坦病毒 Np抗體的結(jié)合活性，且免疫印跡結(jié)果表明未獲得 完整融合蛋白。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明含 GI基因片段的重組桿狀病毒也表達(dá) 出有生物學(xué)活性的糖蛋白。 用 SO．7、GI、GISO．7三種基因的昆蟲(chóng)細(xì)胞表達(dá)產(chǎn)物分別免疫小鼠， 間接免疫熒光、ELISA、微量細(xì)胞培養(yǎng)中和試驗(yàn)及T淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)檢 測(cè)兔疫效果。結(jié)果表明，幾種重組桿狀病毒的表達(dá)產(chǎn)物在機(jī)體內(nèi)均可刺激 產(chǎn)生針對(duì)漢坦病毒的特異性體液免疫及細(xì)胞免疫應(yīng)答。其中GISO．7刺激產(chǎn) 生的抗體滴度最高，且可刺激機(jī)體同時(shí)產(chǎn)生特異性的抗?jié)h坦病毒NP及GP 的抗體：各免疫組小鼠均有部分產(chǎn)生中和抗體：淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)表明， GI SO．7免疫組小鼠脾細(xì)胞對(duì) NP及 GP的增殖反應(yīng)指數(shù)高于陰性對(duì)照組， 并略高于 GI或 SO．7免疫組小鼠脾細(xì)胞的增殖反應(yīng)指數(shù)。 以上研究證明，將漢坦病毒 76－118株 S基因編碼區(qū) 5’端約 0．7Kb片段 與 M基因 GI編碼區(qū)進(jìn)行拼接，構(gòu)建的含 GI SO．7嵌合基因之重組桿狀病 毒可在昆蟲(chóng)細(xì)胞中表達(dá)出有生物學(xué)活性的完整融合蛋白。該表達(dá)產(chǎn)物同時(shí) 具備兩種基因片段編碼蛋白的特點(diǎn)，在小鼠體內(nèi)既可誘導(dǎo)體液免疫又可誘 導(dǎo)細(xì)胞免疫應(yīng)答，且免疫效果優(yōu)于 G！和 SO．7。本研究為 HFRS基因工程 疫苗研制中選擇合適的免疫組分提供了重要的理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2001
【分類(lèi)號(hào)】：R392

【引證文獻(xiàn)】

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1 胡剛;吳興安;王海濤;李璞媛;徐志凱;張芳琳;;漢坦病毒CTL多表位重組腺病毒的構(gòu)建及免疫學(xué)分析[J];科學(xué)技術(shù)與工程;2010年32期

2 胡剛;白文濤;吳興安;王海濤;徐志凱;張芳琳;;漢坦病毒嵌合基因G2S0.7與CTL多表位重組腺病毒的構(gòu)建及免疫學(xué)分析[J];細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志;2010年11期

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1 劉勇;漢灘病毒76-118株G1S0.7和G2S0.7不同嵌合基因的表達(dá)及免疫學(xué)特性研究[D];中國(guó)人民解放軍第四軍醫(yī)大學(xué);2003年

本文編號(hào)：2635549