發(fā)布時(shí)間：2020-04-12 13:39

【摘要】：胰島素基因治療是利用分子生物學(xué)技術(shù),將體外構(gòu)建的能夠在體內(nèi)表達(dá)胰島素的人造基因轉(zhuǎn)移至在糖尿病病人體內(nèi)特定的細(xì)胞內(nèi),使之長(zhǎng)期保留并表達(dá)胰島素的一種實(shí)驗(yàn)性治療手段。如何安全、持續(xù)、穩(wěn)定地將胰島素基因轉(zhuǎn)移至活體細(xì)胞內(nèi)并能合理地按需調(diào)控其表達(dá)等是胰島素基因治療仍沒能解決的核心技術(shù)問題。骨骼肌被視為基因治療中目的基因表達(dá)的良好載體,有如下優(yōu)點(diǎn):①體塊巨大、部位表淺、容易操作;②血運(yùn)豐富、蛋白質(zhì)產(chǎn)生后能迅速入血;③作為永久性細(xì)胞沒有分裂能力,細(xì)胞數(shù)目不變,使外源基因易于在細(xì)胞核內(nèi)長(zhǎng)期保留、其數(shù)目不會(huì)發(fā)生增減;④細(xì)胞間有融合性、外源基因較易向周圍的肌肉細(xì)胞內(nèi)擴(kuò)散、轉(zhuǎn)移效率高;⑤質(zhì)粒作為基因轉(zhuǎn)移的載體具有不含病毒、安全性好,構(gòu)建容易、能夠大量制備,治療效果不受重復(fù)注射次數(shù)的影響等優(yōu)點(diǎn)。但是,就胰島素基因治療而言,肌肉缺乏血糖調(diào)控的基因啟動(dòng)子,胰島素持續(xù)分泌可能會(huì)引起致命的低血糖。重組四環(huán)素耐藥基因操縱子系統(tǒng)能夠在真核細(xì)胞表達(dá),通過這一系統(tǒng)人們能夠調(diào)控外源基因在體內(nèi)的表達(dá)。因此,利用四環(huán)素操縱子表達(dá)系統(tǒng)質(zhì)粒調(diào)控骨骼肌胰島素基因的表達(dá)應(yīng)該是可行的。 目的 構(gòu)建強(qiáng)力霉素調(diào)控的胰島素基因表達(dá)載體,驗(yàn)證其在成肌細(xì)胞內(nèi)受強(qiáng)力霉素調(diào)控后的表達(dá)情況;研究該質(zhì)粒在骨骼肌注射后對(duì)鏈脲佐菌素(STZ)誘導(dǎo)糖尿病小鼠血糖的控制作用及電穿孔對(duì)該質(zhì)粒肌內(nèi)注射后轉(zhuǎn)導(dǎo)效率的影響,探討通過調(diào)控該質(zhì)粒體內(nèi)表達(dá)來調(diào)節(jié)血糖水平的可行性。 方法 1.強(qiáng)力霉素調(diào)控的胰島素基因表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及其在體外成肌細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)調(diào)控 (1)構(gòu)建ptet-mINS 分別用BamHI和ClaI酶切pUHG102-8質(zhì)粒和pINS-ABC質(zhì)粒,將胰島素原基因片段定向克隆到pUHG102-8質(zhì)粒的四環(huán)素耐藥基因啟動(dòng)子下游,得到ptet-mINS質(zhì)粒,并用BamHI和ClaI酶切鑒定插入序列的準(zhǔn)確性。 WP=5 (2)構(gòu)建prTA-tet4-mINS 用XhoI和HindIII酶切prtTA2-1質(zhì)粒,將得到的PhCMV-rtTA2-1/poly(A)片段插入到經(jīng)XhoI酶切的ptet-mINS質(zhì)粒,得到prTA-tet4-mINS質(zhì)粒。 (3)建成prTA-tet4-rhINS 用ScaI和BamHI酶切pLNCX質(zhì)粒,將所得到的無功能5’LTR-(+-Neor片段插入到經(jīng)XhoI酶切的prTA-tet4-mINS上得到最終的prTA-tet4-rhINS質(zhì)粒。直接測(cè)序其正確無誤。 (4)質(zhì)粒導(dǎo)入成肌細(xì)胞系 用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)移法將prTA-tet4-rhINS和pLNCX(一種含有新霉素抗性基因,但不含胰島素基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒基因克隆、表達(dá)質(zhì)粒)導(dǎo)入同一成肌細(xì)胞系(C2C12)細(xì)胞內(nèi)。經(jīng)氨基糖苷(G418,一種新霉素類似物)篩選后,以不同濃度(0(g/ml、2(g/ml及10(g/ml)的強(qiáng)力霉素(Dox)誘導(dǎo)成活細(xì)胞,檢測(cè)誘導(dǎo)后第1、3、5、7天及撤藥后第1,3及5天培養(yǎng)基和細(xì)胞提取物的胰島素(原)水平。留取第5天培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行胰島素原mRNA檢測(cè)。用放射免疫分析(RIA)測(cè)定胰島素(原)水平。C2C12細(xì)胞內(nèi)人胰島素原mRNA用反轉(zhuǎn)錄-多聚酶鏈反應(yīng)技術(shù)(RT-PCR)檢測(cè)。 2.骨骼肌注射的prTA-tet4-rhINS對(duì)不同種系STZ糖尿病小鼠血糖的作用 ①用大腸桿菌擴(kuò)增、堿裂解法提取及聚乙二醇法純化質(zhì)粒prTA-tet4-rhINS和pLNCX;②腹腔內(nèi)注射STZ(150mg/kg)制備Balb/C和昆明種小鼠糖尿病模型(血糖≥16.7 mmol/L,持續(xù)2周以上);③經(jīng)皮向小鼠雙側(cè)后腿骨骼肌內(nèi)各注射prTA-tet4-rhINS質(zhì)粒150μg,共300μg(治療組),注射pLNCX質(zhì)粒者為對(duì)照組,同時(shí)使小鼠分別飲服濃度為0.5g/L和2g/L的Dox水,尾尖取血,測(cè)定每日上午8時(shí)隨機(jī)血糖(葡萄糖氧化酶試紙法),并稱量小鼠體重;④血糖穩(wěn)定下降的第6天,斷頭處死部分小鼠,留取全血、注射部位的骨骼肌及肝臟組織,測(cè)定血清人胰島素(RIA)和C肽(免疫放射定量分析,IRMA)水平以及注射部位小鼠骨骼肌人胰島素原mRNA(RT-PCR)。 3.電穿孔技術(shù)prTA-tet4-rhINS肌肉轉(zhuǎn)導(dǎo)和降血糖的增強(qiáng)作用 ①制備昆明小鼠糖尿病模型(方法同前)。②分單純肌肉注射prTA-tet4-rhINS組(單純注射組,48只)、肌肉注射prTA-tet4-rhINS后電穿孔增強(qiáng)組(電穿孔組,42只)和肌肉注射pLNCX后電穿孔增強(qiáng)組(對(duì)照組,35只),注射質(zhì)粒劑量相同(肌肉注射方法同前),同時(shí)飲服濃度為2g/L的Dox水。監(jiān)測(cè)鼠尾末梢血糖(方法同前)和小鼠體重。③于血糖穩(wěn)定下降的第14天,對(duì)部分小鼠摘眼球取血并留取肝臟、注射部位肌肉。測(cè)定血清中人真胰島素(ELISA)水平及小鼠肌肉組織中人胰島素原基因mRNA(RT-PCR)。④觀察部分對(duì)照組小鼠、電穿孔組血糖控制穩(wěn)定的小鼠及正常小鼠,在飲服進(jìn)而撤除Dox水(2g/L)過程中及在持續(xù)飲服Dox水(2g/L)的情況下,空腹24小時(shí)內(nèi)其血糖水平的變化情況。 WP=6 結(jié)果 1.強(qiáng)力霉素調(diào)控的胰島素基因表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及其在體外成肌細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)調(diào)控 ①直接測(cè)序結(jié)果顯示prTA-tet4-rhINS質(zhì)粒的胰島素基因片段插入方向及核酸順序與預(yù)計(jì)的完全一致;②RT-PCR結(jié)果顯示此質(zhì)粒能在C2C12細(xì)胞內(nèi)表達(dá);③細(xì)胞培養(yǎng)液中的胰島素水平在加藥24小時(shí)后開始增加,至第7天接近達(dá)平臺(tái),撤藥后迅速下降,撤藥后第5天降至基礎(chǔ)水平。④培養(yǎng)基內(nèi)加入不同濃度強(qiáng)力霉素,其胰島素產(chǎn)量明顯不同,10μg/ml時(shí)培養(yǎng)基內(nèi)的胰島素水平(23.32(1.47mIU/L)明顯較2μg/ml時(shí)(13.29(1.40mIU/L)高(p0.05)。細(xì)胞內(nèi)和培養(yǎng)基中的胰島素水平無明顯差異(p0.05),細(xì)胞內(nèi)胰島素水平在Dox為10μg/ml時(shí)和2μg/ml時(shí)分別為23.8
【圖文】：

ab胰島素放免分析試劑盒購(gòu)自中國(guó)北京中國(guó)原子能研究所(批內(nèi) CV＝6.73％， CV＝9.29%)；引物由寶生物工程（大連）有限公司合成；JM109 感受態(tài)大腸、凝膠回收試劑盒、RNA 提取試劑盒（Catrimox-14 RNA Isolation Kit, ver2.11）相關(guān)的 DNA 限制性內(nèi)切酶、Taq 酶、DL-2000，λ-HindⅢ分子量標(biāo)樣、逆轉(zhuǎn)多聚酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）相關(guān)的試劑盒（TakaRa RNA PCR kit (AMV) ver 2.1）基焦磷酰胺水（diethyl pyrocarbonate，，DEPC）均購(gòu)自寶生物工程（大連）有司。Trizol 試劑購(gòu)自美國(guó) Invitrogen 公司；其他相關(guān)試劑均系國(guó)產(chǎn)分析純或電試劑。試劑的具體配制見附錄。

構(gòu)建胰島素基因表達(dá)調(diào)控質(zhì)粒時(shí)所用的無功能插入片的強(qiáng)力霉素調(diào)控的胰島素基因表達(dá)質(zhì)粒（prTA-tet4-r插入序列來自該質(zhì)粒的 ScaI 和 BamHI 酶切后的較小序列中含有新霉素抵抗基因（Neor），不含胰島素基因因，LTR 為長(zhǎng)末端重復(fù)序列，PhCMV IE 巨細(xì)胞病毒立美國(guó) PE 公司），PCR 儀（美國(guó) PE 公司）等本日立公司），DHP-9002 型電熱恒溫培養(yǎng)箱（DSHZ-300 多用途水浴恒溫震蕩器（中國(guó)江蘇儀（中國(guó)大連捷邁科貿(mào)有限公司）。50ml 培養(yǎng)瓶）。隔水式恒溫培養(yǎng)箱（中國(guó)湖北黃石醫(yī)療儀器司），TY92－II 型超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)（中國(guó)寧
【學(xué)位授予單位】：大連醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2004
【分類號(hào)】：R346

【參考文獻(xiàn)】

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1 李鴻,蘇本利;糖尿病基因治療的新進(jìn)展[J];生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展;2003年01期

2 李鴻,蘇本利,劉海霞,張雪揚(yáng),呂申,劉敏,紀(jì)曉,F.BOSCH;肌肉注射可調(diào)控胰島素基因?qū)μ悄虿⌒∈蠼堤亲饔肹J];生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展;2004年03期

3 楊郁,李昌臣,李躍,馬郁芳,白然,杜建玲,朱佩錦,谷玲;體內(nèi)直接人胰島素原基因轉(zhuǎn)移對(duì)糖尿病小鼠治療作用的研究[J];中國(guó)糖尿病雜志;2002年06期

4 白然,李昌臣,李躍,馬郁芳,陳磊,谷玲;人胰島素原基因在體外培養(yǎng)的NIH3T3細(xì)胞中的基因轉(zhuǎn)移和表達(dá)的研究[J];中華內(nèi)分泌代謝雜志;2000年01期

5 沈坤堂 ,秦新裕 ,肖華勝 ,張新 ,許相儒 ,韓澤廣;基因工程改造非β細(xì)胞分泌成熟胰島素的研究(英文)[J];Chinese Medical Journal;2002年04期

6 張國(guó)華,沈冬,金彩科,譚小凡,陳光慧,湯健;電脈沖介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)移效率的實(shí)驗(yàn)研究[J];中華醫(yī)學(xué)雜志;2001年15期

本文編號(hào)：2624780