【摘要】：脊髓損傷(spinal cord injury, SCI)這一重大疾病在全球呈現(xiàn)高發(fā)生率、高致死率和高致殘率的特點,其救治一直是世界性的醫(yī)學(xué)難題之一。相對于周圍神經(jīng)損傷后的自發(fā)性修復(fù),成年哺乳動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system, CNS)受損后,被截斷的神經(jīng)元軸突再生能力極其有限,造成的運動感覺等功能障礙難以恢復(fù)。因此,脊髓損傷后的神經(jīng)再生與修復(fù)仍是目前研究的熱點和難點。 上世紀(jì)八十年代,Aguayo及其同事突破性的研究顛覆了神經(jīng)科學(xué)界的傳統(tǒng)觀念,他們發(fā)現(xiàn)中樞神經(jīng)軸突再生困難并非是缺乏再生能力,而是中樞內(nèi)微環(huán)境限制了神經(jīng)軸突的再生。近年來的研究表明,有兩個主要因素形成了不利于軸突再生的微環(huán)境。首先是少突膠質(zhì)細胞及其形成的髓鞘上含有多種軸突生長抑制因子,在CNS受損后被大量釋放出來,如Nogo-A、髓鞘相關(guān)糖蛋白(MAG)、少突膠質(zhì)細胞髓鞘糖蛋白(OMgp),三者都是通過與神經(jīng)元上的NgR受體復(fù)合物結(jié)合,激活RhoA介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)通路,調(diào)節(jié)細胞骨架蛋白,導(dǎo)致生長錐的塌陷而抑制軸突再生。阻礙中樞神經(jīng)軸突再生的另一重要原因是膠質(zhì)瘢痕,它主要是由膠質(zhì)細胞和結(jié)締組織成分構(gòu)成,被認為是阻礙再生軸突穿越的機械屏障。此外,由瘢痕細胞分泌的細胞外基質(zhì)成分在損傷區(qū)的堆積也是重要的抑制因素,主要代表是硫酸軟骨素蛋白多糖(CSPGs)和細胞粘合素-R(Tenascin-R, TN-R)。 TN-R是目前已知的一個抑制神經(jīng)軸突再生的重要因子。它屬于細咆粘合素家族,該家族還包括Tenascin-C、-W、-X、-Y。TN-R是一個大的多域糖蛋白,形成二聚體(160kDa亞型)或三聚體(180kDa亞型),它存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng),主要由少突膠質(zhì)細胞和某些類型的神經(jīng)元表達并分泌到細胞外基質(zhì)中。體外研究發(fā)現(xiàn),TN-R蛋白對神經(jīng)元有抗細胞粘附的排斥作用,以及阻礙神經(jīng)突起生長的抑制作用。這些作用是由TN-R蛋白的EGF-L結(jié)構(gòu)域與神經(jīng)元生長錐上的細胞粘附分子F3/F11結(jié)合后介導(dǎo)的。脊髓損傷后,傷灶處TN-R mRNA的表達上調(diào)。有學(xué)者利用TN-R基因敲除鼠發(fā)現(xiàn)脊髓損傷后TN-R可以阻礙運動神經(jīng)元與其他神經(jīng)元重建突觸聯(lián)系,從而限制了SCI后運動功能的恢復(fù)。對TN-R基因敲除鼠面神經(jīng)損傷模型的研究也發(fā)現(xiàn)TN-R不利于神經(jīng)損傷后的功能恢復(fù)。 為了消除軸突再生抑制因子的抑制效應(yīng),神經(jīng)科學(xué)家們常常應(yīng)用抗體阻斷抑制因子或其受體,以此達到促進神經(jīng)元軸突再生及脊髓損傷等CNS損傷后功能恢復(fù)的目的。如采用IN-1單克隆抗體中和Nogo-A以封閉其抑制活性的策略就收到了很好的療效。除了直接應(yīng)用特異性抗體進行封閉即被動免疫治療外,還可以通過主動免疫刺激機體產(chǎn)生相應(yīng)的中和抗體。相關(guān)研究表明通過不同主動免疫方式刺激機體產(chǎn)生對抗相關(guān)抑制性因子的抗體,能夠有效的促進損傷軸突的再生及功能恢復(fù)。然而,雖然主動免疫能夠起到良好的作用,但是在臨床實踐中,絕大多數(shù)人也許不會考慮在受傷前就進行此種疫苗的接種。再者,損傷后急性期單獨采用主動免疫方式接種,機體也需要經(jīng)歷較長的一段時間后才能夠產(chǎn)生保護性抗體,而實際上此時早期干預(yù)治療很有必要,有利于傷后的康復(fù)。因此,在損傷急性期通過被動免疫治療應(yīng)用中和抗體消除或削弱相關(guān)抑制性因子可能更具有臨床可行性。 綜上,TN-R已經(jīng)被證實能抑制神經(jīng)軸突再生并阻礙脊髓損傷后的功能恢復(fù),因此以TN-R為治療靶點,開發(fā)拮抗TN-R功能的藥物,如TN-R的抗體藥物等,將為臨床上治療脊髓損傷提供新的選擇和手段。本研究擬以人TN-R蛋白EGF-L結(jié)構(gòu)域為靶點,設(shè)計并合成多肽片段作為抗原制備兔源性TN-R多克隆抗體,檢測其效價和特異性,并在體外觀察其對大鼠皮層神經(jīng)元突起生長的影響；最后.建立大鼠背側(cè)半橫斷脊髓損傷模型,對其進行TN-R多克隆抗體被動免疫治療,觀察抗體對脊髓損傷大鼠的療效。 第一部分Tenascin-R多克隆抗體的制備及鑒定 目的：以人TN-R蛋白EGF-L結(jié)構(gòu)域為靶點制備TN-R多克隆抗體,檢測其效價,并初步驗證其對靶分子的特異性識別能力。 方法：根據(jù)人TN-R蛋白EGF-L結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列信息設(shè)計多肽抗原,序列長度在10-20個氨基酸殘基之間,合成后與載體蛋白相偶聯(lián),充分乳化后免疫新西蘭大白兔,免疫前采集兔血清用作陰性對照。經(jīng)過一次基礎(chǔ)免疫和三次加強免疫,ELISA測定抗體效價達標(biāo)后放血并分離血清,獲得的抗血清采用抗原親和純化。間接ELISA法測定純化后抗體的效價。以人重組TN-R蛋白為上樣蛋白,制備的TN-R多克隆抗體為一抗,Western Blot法檢驗抗體的特異性。 結(jié)果：查詢GenBank數(shù)據(jù)庫,獲取人TN-R蛋白EGF-L結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列信息(aa199-323, ID:NP003276.3),將肽段CDSEYSGDDCSELRCP確定為多肽抗原,經(jīng)合成獲得多肽10mg,純度85%。免疫前獲得4mL陰性對照血清。第三次加強免疫后少量采血行ELISA法測定抗血清中多抗效價1：105,達到預(yù)期效價,耳緣靜脈放血收獲血液共26mL,制備抗血清10mL,經(jīng)抗原親和純化后獲得多克隆抗體8mL, BCA法測得濃度為0.36mg/mL。經(jīng)間接ELISA法檢測,TN-R多抗滴度1：512,000。Western Blot結(jié)果顯示,在TN-R多抗側(cè)相對分子量約180kDa處出現(xiàn)陽性條帶,而對照血清側(cè)為陰性,表明TN-R多抗能與上樣的人重組TN-R蛋白結(jié)合。 結(jié)論：通過合成多肽抗原,成功制備了兔源性TN-R多克隆抗體,其效價高、對TN-R蛋白有良好的特異結(jié)合性,為進一步研究奠定了基礎(chǔ)。 第二部分Tenascin-R多克隆抗體對大鼠皮層神經(jīng)元及其突起生長的影響 目的：了解體外培養(yǎng)的大鼠皮層神經(jīng)元及其突起在TN-R蛋白上的生長情況,以及TN-R多克隆抗體對其有無影響,為TN-R多克隆抗體的應(yīng)用提供體外實驗數(shù)據(jù)。 方法：在西胞多孔培養(yǎng)板上包被TN-R蛋白,經(jīng)過免疫前血清或者TN-R多克隆抗體處理后,加入原代培養(yǎng)的新生SD大鼠皮層神經(jīng)元(小組織塊、單層細胞),間接免疫熒光細胞化學(xué)法對神經(jīng)元及其突起進行染色。定性觀察不同包被基質(zhì)的邊界抑制效應(yīng)以及不同基質(zhì)環(huán)境中神經(jīng)元的黏附數(shù)量,利用軟件對神經(jīng)元突起進行長度測量和統(tǒng)計學(xué)分析。 結(jié)果：TN-R蛋白存在區(qū)域的邊界抑制效應(yīng)十分明顯,大鼠皮層神經(jīng)元的突起不能長入TN-R蛋白的涂布區(qū)域,在其邊緣停止生長或轉(zhuǎn)向生長,單純包被PLL則沒有此現(xiàn)象,此外TN-R蛋白區(qū)域內(nèi)黏附的神經(jīng)元數(shù)目很少。TN-R多克隆抗體處理后能減弱這些抑制效應(yīng),但免疫前血清沒有類似作用。對三組神經(jīng)元突起長度進行測量和統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn),三組數(shù)值差異具有顯著性(F=58.654,P=0.000),其中正常對照組神經(jīng)元的平均突起長度為152.35±11.29μm,培養(yǎng)在TN-R蛋白+免疫前血清包被基質(zhì)上的神經(jīng)元,突起生長受到顯著抑制,平均突起長度為38.79±4.96μm(P0.001)。當(dāng)基質(zhì)經(jīng)過TN-R多克隆抗體處理后,TN-R蛋白的抑制作用得到部分逆轉(zhuǎn),神經(jīng)元突起長度為112.41±8.41μm(P0.001),但與正常對照組相比仍有統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05)。 結(jié)論：在體外,TN-R蛋白能明顯抑制神經(jīng)元的黏附及突起的生長伸展,TN-R多克隆抗體的應(yīng)用能有效地部分阻斷TN-R蛋白對神經(jīng)元及其突起的抑制作用。 第三部分脊髓半橫斷模型大鼠Tenascin-R多克隆抗體被動免疫治療的效果評估 目的：建立大鼠背側(cè)半橫斷脊髓損傷模型,應(yīng)用TN-R多克隆抗體被動免疫治療,觀察體內(nèi)治療效果并對相關(guān)機制進行初步探討。 方法：33只成年雌性SD大鼠隨機分為假手術(shù)組(8只)、對照組(13只)和實驗組(12只)。假手術(shù)組大鼠僅接受椎板切開術(shù),另外兩組均行T8-9脊髓背側(cè)半橫斷術(shù),并在皮下埋置微量滲透壓泵,分別局部給予兔免疫前血清和TN-R多克隆抗體。術(shù)后3天和28天取各組脊髓作冰凍切片,免疫組織化學(xué)染色檢測滲透入脊髓損傷灶處的兔源性抗體。對術(shù)后3天的組織切片行間接免疫熒光染色檢測損傷灶及其周圍組織TN-R蛋白表達情況。術(shù)后3天,提取各組脊髓組織蛋白并測定蛋白濃度,利用蛋白質(zhì)沉淀技術(shù)及Western Blot檢測方法對各組脊髓損傷處組織行RhoA活性分析。術(shù)后1天及每周,對各組動物盲法行BBB行為學(xué)評分以評價大鼠運動功能的恢復(fù)情況。 結(jié)果：兔源性抗體滲透性分析：術(shù)后3天,假手術(shù)組脊髓切片兔源性抗體免疫組化染色陰性,對照組及實驗組脊髓損傷處免疫組化染色均為陽性；術(shù)后28天,對照組及實驗組脊髓傷灶及其周圍組織仍可檢測到兔源性抗體。 TN-R多抗結(jié)合特異性分析：實驗組切片TN-R染色強度明顯弱于對照組,但與假手術(shù)組相比免疫強度稍強；對各組TN-R免疫熒光染色的IOD值進行定量統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn),三組IOD值差異具有顯著性(F=24.197,P=0.000),對照組IOD值顯著高于假手術(shù)組(P0.01),實驗組IOD值比對照組顯著降低(P0.05),但仍高于假手術(shù)組(P0.01)。 脊髓組織活化RhoA信號檢測：各組RhoA蛋白總表達量無差異,但活化RhoA蛋白量以對照組最高,實驗組次之,假手術(shù)組最少。以RhoA總蛋白為校正標(biāo)準(zhǔn),獲取活化RhoA蛋白光密度指數(shù)為統(tǒng)計量進行統(tǒng)計學(xué)分析發(fā)現(xiàn),三組光密度指數(shù)值差異具有顯著性(F=168.224,P=0.000),對照組的活性RhoA顯著高于假手術(shù)組(P0.001),實驗組的活性RhoA比對照組顯著降低(P0.001),但仍高于假手術(shù)組(P0.001)。 BBB評分結(jié)果：在4周的觀察期內(nèi),大鼠后肢運動功能逐漸恢復(fù),但從7天開始一直到觀察終點28天,在各固定時間點,實驗組大鼠的BBB評分始終要高于對照組(P0.01),總體來說,兩組BBB評分也存在統(tǒng)計學(xué)差異(F=16.279,P=0.001)。21天時,BBB評分達到或超過14分的比率,實驗組要高于對照組(62.5%vs.11.1%),統(tǒng)計學(xué)上有顯著性差異(P=0.0498);28天時,實驗組動物的這一比率也要高于對照組(87.5%vs.22.2%),差異具有顯著性(P=0.0152)。 結(jié)論：通過微量滲透壓泵的局部給藥,TN-R多克隆抗體能在不少于4周的時間窗內(nèi)持續(xù)滲透入損傷脊髓組織,并且能夠與組織中大部分上調(diào)的TN-R蛋白特異性結(jié)合。TN-R多抗可顯著削弱胞內(nèi)軸突再生抑制信號的激活,從而促進脊髓損傷后神經(jīng)元軸突的再生,以及損傷脊髓的功能恢復(fù)。 總結(jié) 本研究制備了一種針對軸突再生抑制因子TN-R的多克隆抗體,該抗體是以人TN-R蛋白EGF-L結(jié)構(gòu)域為靶點,通過合成多肽抗原制備的,經(jīng)鑒定具有高效價與良好的特異性,對其在體外和體內(nèi)的功能進行檢測和評估發(fā)現(xiàn),該抗體能顯著削弱TN-R蛋白對神經(jīng)元及其突起的抑制作用,阻礙中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)的神經(jīng)抑制信號傳遞,促進受損脊髓的功能恢復(fù)。但是,這一中和抗體的生物安全性還需要進一步評估,其相關(guān)的作用機制也有待于闡明。本研究提供的證據(jù)表明：TN-R拮抗劑的被動免疫具有治療脊髓損傷的潛在應(yīng)用價值,為治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷提供了一種新的、有前途的手段和策略。
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R392;R651.2

【參考文獻】

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本文編號：2613031