發(fā)布時(shí)間：2020-03-28 03:54

【摘要】：骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis, OP)是一種以骨小梁減少、骨脆性增加為病理特征的代謝性骨病。在我國(guó),約有2.1億人骨量低于正常標(biāo)準(zhǔn),至少有近7000萬(wàn)人患有骨質(zhì)疏松癥。其中絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的發(fā)病率占據(jù)了骨質(zhì)疏松總發(fā)病率的70%以上,由絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松引發(fā)的骨脆性骨折,致殘率和致死率均較高,嚴(yán)重威脅著中老年婦女的骨骼健康。因此,研制一種能夠有效治療絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松的疫苗,能夠顯著提高中老年婦女生活質(zhì)量、降低社會(huì)和家庭負(fù)擔(dān)。 長(zhǎng)期以來,雌激素(estrogen)缺乏被認(rèn)為是誘發(fā)絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松的關(guān)鍵病因。激素替代療法(hormone replacement therapy, HRT),尤其是雌激素替代療法(estrogen replacement therapy, ERT)在臨床上的廣泛應(yīng)用,也確實(shí)取得了一定的效果。有研究表明,雌激素能夠通過下調(diào)IL-1、IL-6和TNF-α等炎癥因子抑制破骨細(xì)胞分化,進(jìn)而抑制骨吸收。但是,單純的雌激素水平降低并不能充分解釋性腺機(jī)能衰退導(dǎo)致的骨丟失。使用基因敲除鼠的研究發(fā)現(xiàn),將雌激素受體a和β同時(shí)敲除的小鼠去勢(shì)(ovariectomy, OVX),小鼠僅發(fā)生了輕微的骨質(zhì)疏松,而單純敲除雌激素α或β受體,小鼠則具有正常的骨量。這說明雌激素缺乏并非絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松的單一誘因。 研究發(fā)現(xiàn),若在去勢(shì)的同時(shí)摘除垂體(hypophysectomy),小鼠的骨量高于單純?nèi)?shì)的小鼠,這表明垂體分泌的激素在絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松發(fā)生過程中發(fā)揮著非常關(guān)鍵的作用。垂體主要分泌卵泡刺激素(follicle-stimulating hormone, FSH)和黃體生成素(luteinizing hormone, LH)。在圍絕經(jīng)期早期,FSH水平就已經(jīng)開始升高,并且FSH水平的升高與骨量的丟失相一致。但是,之前僅將FSH水平的升高作為絕經(jīng)開始的標(biāo)志之一,而未將其認(rèn)為是骨質(zhì)疏松的誘發(fā)因素。然而隨著研究的深入,發(fā)現(xiàn)圍絕經(jīng)期存在FSH血漿水平異常升高、FSH血漿濃度與骨丟失密切相關(guān)等現(xiàn)象。并且最近的研究發(fā)現(xiàn),FSH通過促進(jìn)破骨細(xì)胞的形成,在骨質(zhì)疏松發(fā)生中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。Mone ZaiDi等人發(fā)現(xiàn)破骨細(xì)胞的表面存在卵泡刺激素受體(follicle-stimulating hormone receptor, FSHR), FSH能夠直接作用于破骨細(xì)胞表面的FSHR,激活MEK/Erk、NF-κB、Akt信號(hào)通路,促進(jìn)破骨細(xì)胞的形成,進(jìn)而促進(jìn)骨吸收,調(diào)節(jié)骨量。這些研究結(jié)果均提示,FSH是誘發(fā)絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松的關(guān)鍵病因。 因此,我們認(rèn)為阻斷FSH與FSHR的結(jié)合,能夠有效地治療絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松。 方法 基于Mone ZaiDi等人的研究結(jié)果,我們?cè)O(shè)計(jì)了針對(duì)FSH的絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松蛋白疫苗,并進(jìn)行了體外實(shí)驗(yàn)和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)： (1)檢測(cè)外源性FSH對(duì)于破骨細(xì)胞分化和成骨細(xì)胞分化的影響。在破骨細(xì)胞誘導(dǎo)分化過程中和成骨細(xì)胞誘導(dǎo)分化過程中外源性加入FSH,檢測(cè)其在不同濃度條件下對(duì)破骨細(xì)胞分化和成骨細(xì)胞分化的影響。 (2)制備GST-hFSHβ重組蛋白。利用大腸桿菌對(duì)于密碼子的偏愛性,優(yōu)化人FSHp亞基(human FSH β subunit, hFSHβ)的成熟肽編碼序列。通過化學(xué)合成的方法獲得優(yōu)化后的hFSHβ基因,并通過BamH I-EcoR I酶切位點(diǎn)克隆至pGEX-4T-1原核表達(dá)載體。IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后,利用GSTrap親和層析柱純化GST-hFSHβ重組蛋白,并通過透析、冷凍干燥等方法,進(jìn)行蛋白的除鹽、濃縮和定量。 (3)以GST-hFSHβ重組蛋白為抗原免疫OVX大鼠,以期治療OVX大鼠的骨質(zhì)疏松。將GST-hFSHβ重組蛋白與弗氏佐劑等體積混合后,皮下注射(subcutaneously, s.c.)免疫OVX大鼠,并通過Micro CT分析、三點(diǎn)彎曲實(shí)驗(yàn)、壓力實(shí)驗(yàn)、組織形態(tài)學(xué)檢測(cè)和血尿生化分析.ELISA檢測(cè)等方法,評(píng)價(jià)以GST-hFSHβ重組蛋白為抗原免疫OVX大鼠對(duì)于OVX大鼠骨質(zhì)疏松的治療情況。 結(jié)果 通過體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn),我們獲得了如下實(shí)驗(yàn)結(jié)果： (1)外源性FSH能夠以劑量依賴方式促進(jìn)破骨細(xì)胞分化,且該作用能夠被抗hFSHβ抗血清阻斷。在骨髓單核細(xì)胞向破骨細(xì)胞誘導(dǎo)分化過程中,外源性加入3ng/mL、10ng/mL和30ng/mL的FSH,發(fā)現(xiàn)外源性FSH對(duì)于細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)無明顯影響的同時(shí),破骨細(xì)胞分化的數(shù)量以及破骨細(xì)胞細(xì)胞核形成的數(shù)量對(duì)于FSH濃度均呈劑量依賴性升高,且在較低濃度(3ng/mL)時(shí)即可有明顯的促進(jìn)作用。在破骨細(xì)胞誘導(dǎo)分化過程中,加入抗hFSHβ抗血清,發(fā)現(xiàn)高濃度FSH (30ng/mL)對(duì)于破骨細(xì)胞分化的促進(jìn)作用被阻斷。 (2)成功在大腸桿菌內(nèi)表達(dá)GST-hFSHβ重組蛋白。通過刪除hFSHβ信號(hào)肽序列、利用大腸桿菌偏愛密碼子對(duì)hFSHβ成熟肽核酸序列進(jìn)行優(yōu)化以及對(duì)蛋白誘導(dǎo)表達(dá)條件(IPTG濃度、誘導(dǎo)時(shí)間、誘導(dǎo)溫度、轉(zhuǎn)速)進(jìn)行優(yōu)化等方法,提高蛋白表達(dá)量。以優(yōu)化后的條件表達(dá)GST-hFSHβ重組蛋白,蛋白表達(dá)量可達(dá)到菌體總蛋白的31.4%。通過GSTrap親和層析柱純化、透析、冷凍干燥,獲得了干燥的GST-hFSHβ重組蛋白。 (3)以GST-hFSHβ重組蛋白為抗原免疫OVX大鼠,成功治療了OVX大鼠的骨質(zhì)疏松。末次免疫后第10天,OVX大鼠血清的抗體效價(jià)為1：128萬(wàn),說明我們以GST-hFSHβ重組蛋白為抗原免疫OVX大鼠,成功誘導(dǎo)大鼠產(chǎn)生了針對(duì)FSH的多克隆抗體,并且獲得了較高的抗體效價(jià)。骨密度(bone mineral density, BMD)檢測(cè)結(jié)果顯示治療組大鼠的BMD得到了顯著改善,6月時(shí)可達(dá)到Sham組的90%,12月時(shí)約為Sham組的85%,并且均顯著高于OVX組(P0.01)。Micro CT分析結(jié)果表明,GST-hFSHβ重組蛋白免疫治療后,OVX大鼠股骨的Bone Volume/Total Volume (BV/TV), Trabecular Thickness (Tb.Th)和Trabecular Number (Tb.N)均顯著高于OVX組,而Bone Surface Area/Bone Volume (BSA/BV), Trabecular Spacing (Tb.Sp)和Trabecular Pattern Factor(TPF)均顯著低于OVX組,說明在體免疫治療后,OVX大鼠的骨小梁丟失得到了明顯緩解,骨量顯著提高。三點(diǎn)彎曲(three-point bending test)和壓力實(shí)驗(yàn)(compression test)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,免疫治療后,OVX大鼠皮質(zhì)骨和松質(zhì)骨的力學(xué)性質(zhì)得到了顯著提高,并且該結(jié)果支持BMD檢測(cè)和Micro CT分析的結(jié)果。組織形態(tài)學(xué)檢測(cè)的結(jié)果也證實(shí)了力學(xué)檢測(cè)、BMD檢測(cè)和Micro CT分析的實(shí)驗(yàn)結(jié)果,均顯示治療后OVX大鼠的骨小梁參數(shù)得到了顯著改善,并且抗酒石酸鹽酸性磷酸酶(tartrate resistant acid phosphatase, TRAP)染色結(jié)果表明,GST-hFSHβ重組蛋白免疫治療后,OVX大鼠股骨生長(zhǎng)板附近的破骨細(xì)胞數(shù)量顯著下降。生化分析以及ELISA檢測(cè)表明,治療組OVX大鼠的堿性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)、骨鈣素(osteocalcin, OC)、尿鈣(calcium, Ca)、尿磷(phosphorus, P)和尿脫氧吡啶酚(deoxypyridinoline, DPD)等絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松相關(guān)參數(shù)的升高均得到了顯著抑制。 結(jié)論 使用基于FSHp的蛋白疫苗免疫OVX大鼠,能夠顯著緩解大鼠OVX誘發(fā)的骨質(zhì)疏松,證實(shí)FSH信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在性腺機(jī)能衰退導(dǎo)致的骨丟失中發(fā)揮重要作用,為使用基于FSH的抗絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松蛋白疫苗治療人絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松提供了動(dòng)物實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
【學(xué)位授予單位】：西北大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R580;R392

【參考文獻(xiàn)】

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