【摘要】： era基因是1986年測定大腸桿菌基因組序列時(shí)，在編碼RNaseⅢ的rnc基 因下游發(fā)現(xiàn)的一個(gè)開放讀框，其編碼的蛋白具有鳥苷酸結(jié)合活性，氨基酸序列與 人和酵母的Ras有明顯相似性，故命名為E.coli Ras-like（era）基因。后來的研究表 明，era的同源序列存在于所有探討過的細(xì)菌中，era編碼的Era蛋白并不屬于 Ras家族，其獨(dú)特的C端使其成為一個(gè)新的G蛋白亞家族。 Era蛋白由兩個(gè)結(jié)構(gòu)域組成，N端是一個(gè)典型的鳥苷酸結(jié)合蛋白結(jié)構(gòu)域，與 其它G蛋白有較高的同源性；C端為Era家族所特有，，與其它蛋白家族無任何同 源性，其中含有一個(gè)RNA結(jié)合功能結(jié)構(gòu)域—KH結(jié)構(gòu)域。大腸桿菌era是屬于 rnc操縱元的一個(gè)細(xì)菌生存必需的基因，并參與細(xì)胞周期的調(diào)控，Era可以特異 地與16S-rRNA結(jié)合。陳蘇民教授在美國NIH工作期間，以大腸桿菌Era的C 端序列為靶序列，通過計(jì)算機(jī)搜索，發(fā)現(xiàn)從線蟲、小鼠到人都有與細(xì)菌Era同源 的EST序列，以此為線索，成功地克隆了人和小鼠全長的era-cDNA。在此基礎(chǔ) 上，本文對(duì)人Era的組織表達(dá)譜及其功能進(jìn)行了相關(guān)研究。 在本研究工作中，首先對(duì)人era的表達(dá)分布規(guī)律進(jìn)行探索。1、人era-mRNA 的組織分布規(guī)律：以人era編碼區(qū)基因?yàn)樘结�，用CLONTECH公司的MTN和MTE ＄四旱醫(yī)大學(xué)俗士攀位論文 第7 頁 雜交膜進(jìn)行雜交，發(fā)現(xiàn)人。。－mRNA的大小為2．ZKb，分布于所有檢測的組織和 細(xì)胞系中，但表達(dá)水平有很大差異。表達(dá)最高的組織為心尖部、肝臟、胎肺和甲 狀腺。2、人。。。的蛋白表達(dá)分布規(guī)律：用課題組制備并經(jīng)過親和純化的兔抗人 Era多克隆抗體對(duì)幾種胎兒組織進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，結(jié)果人Era蛋白分布于 絕大多數(shù)所檢測的組織，由強(qiáng)到弱依次為胰臟、肺、心臟、脾臟、胃、小腸、肝 臟和腎臟。 經(jīng)免疫電鏡檢測大腸桿菌Era定位于胞漿膜的內(nèi)側(cè)面，其C端對(duì)細(xì)胞內(nèi)定 位有著重要意義。為分析人ERA在細(xì)胞內(nèi)的定位，構(gòu)建了人Era與綠色熒光蛋白 融合的真核表達(dá)載體pSMEGFP－h(huán)Era和PEGFP－CI－h(huán)Era，即目的蛋白分別位于熒 光標(biāo)簽蛋白（EGFP）的N端和C端。瞬時(shí)轉(zhuǎn)染NIH3T3細(xì)胞，帶熒光的融合蛋白 主要位于靠近核膜的胞漿部分；進(jìn)一步用純化的兔抗人Era多克隆抗體對(duì)類風(fēng)濕 關(guān)節(jié)炎滑膜細(xì)胞系RA，骨肉瘤細(xì)胞系MG63、胃癌細(xì)胞系7901等幾種培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn) 行問接免疫熒光檢測，發(fā)現(xiàn)均有強(qiáng)弱不等的熒光，且主要分布于胞漿中。表明人 Era具有不同于大腸桿茵Era的細(xì)胞內(nèi)定位，其細(xì)胞內(nèi)分布以胞漿為主，可能具 有與細(xì)菌Era不同的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。 為研究人Era對(duì)細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞周期的影響，進(jìn)行以下工作：1、對(duì)人Era 的氨基酸序列進(jìn)行了計(jì)算機(jī)分析，在此基礎(chǔ)上構(gòu)建了人Era的定點(diǎn)突變體，其突 變的位置分別針對(duì)N端結(jié)構(gòu)域的GTP結(jié)合位點(diǎn)和C端結(jié)構(gòu)域的KH基序；2、 帶HA標(biāo)簽的野生型和突變型人Era的真核表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染Nll－I3T3細(xì)胞，篩選 到穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞株。3、對(duì)穩(wěn)定表達(dá)人Era細(xì)胞株的細(xì)胞形態(tài)和細(xì)胞周期進(jìn)行 分析，發(fā)現(xiàn)野生型人Era對(duì)細(xì)胞生長有促進(jìn)作用，而KH基序突變后對(duì)細(xì)胞生長 起抑制作用。流式細(xì)胞儀分析表明，轉(zhuǎn)染野生型Era的細(xì)胞株表現(xiàn)為GZ期和S 期細(xì)胞增多，可能為DNA合成旺盛的結(jié)果；轉(zhuǎn)染Era S36N細(xì)胞株各時(shí)相細(xì)胞所 占百分?jǐn)?shù)變化不明顯；轉(zhuǎn)染 Era 31 ON的細(xì)胞株 S期細(xì)胞和 GZ期細(xì)胞增多異常 顯著，結(jié)合細(xì)胞形態(tài)和生長曲線，可能存在細(xì)胞周期阻滯；即在細(xì)胞DNA復(fù)制后 期不能向M期轉(zhuǎn)化。 進(jìn)一步使用完全可調(diào)控誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)突變型人Era，以深入研究該蛋白 的功能。在構(gòu)建穩(wěn)定高表達(dá)蛻皮激素受體基因的細(xì)胞株3V3的基礎(chǔ)上，轉(zhuǎn)染突 變型人Era的表達(dá)載體進(jìn)行壓力篩選，對(duì)所得到的單克隆細(xì)胞株進(jìn)行誘導(dǎo)與未誘 DopGI’－’’’ent ofBtochthe andMolecularmp FMMU2001 竄回旱醫(yī)大學(xué)博士學(xué)位論文 章 呂 頁 導(dǎo)條件下細(xì)胞周期的分析，結(jié)果表明未誘導(dǎo)加酒精的對(duì)照細(xì)胞可以引起細(xì)胞凋 亡，而Era誘導(dǎo)表達(dá)后可以顯著抑制凋亡細(xì)胞的數(shù)量，Western表明Era S36N 可以誘導(dǎo)細(xì)胞仇 1－2表達(dá)，提示人 Era可能與細(xì)胞凋亡相關(guān)。 為進(jìn)一步研究人Era的作用機(jī)理，對(duì)其結(jié)合蛋白的功能區(qū)進(jìn)行鑒定，將人 。。a基因克隆入融合表達(dá)載體 PRSETB中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌 BL21DE3（pLysS），經(jīng) IPTG誘導(dǎo)，表達(dá)6His－h(huán)Era融合蛋白。光密度掃描結(jié)果表明其占菌體總蛋白50％ 以上，表達(dá)產(chǎn)物分子量約為42KD，以包涵體形式存在。在SM i存在條件下，包 涵體溶解，利用6Hk與過渡態(tài)金屬離子N廣高親合力結(jié)合的性質(zhì)，用N廣一叮A 親和樹脂一步法純化，即獲得純度達(dá)96％以上的6His－h(huán)Era融合蛋白。將純化的 蛋白進(jìn)行包被，從噬菌體表面呈現(xiàn)隨機(jī)十＝肽庫中經(jīng)過三輪淘篩（Biopanning）， 并用ELISA檢測，篩選到具有人Era結(jié)合活性的陽性重組噬菌體克隆，測序后發(fā) 現(xiàn)大多（7／9）具有 HxHSxxH的氨基酸序列，初步認(rèn)為是人 Era的結(jié)合基序，為 進(jìn)一步Era結(jié)合蛋白基因的克隆及其功能研究提供了依據(jù)。
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2001
【分類號(hào)】：Q784

【引證文獻(xiàn)】

相關(guān)博士學(xué)位論文 前1條

1 黃勇;Era及其相互作用因子功能研究[D];第四軍醫(yī)大學(xué);2007年

本文編號(hào)：2602741