【摘要】： 慢性HBV感染的抗病毒治療一直是醫(yī)學界的重大難題，現(xiàn)有干擾素和拉米夫定的臨床療效有限，不斷嘗試進行的其它治療方法，至今又尚無令人滿意的結(jié)果，RNA干擾技術的出現(xiàn)，為處于困境中的研究又帶來一線新的希望。 RNA干擾(RNA interference，RNAi)是指由雙鏈RNA(double-stranded RNA，dsRNA)以序列特異性的方式引發(fā)的轉(zhuǎn)錄后同源性RNA降解的現(xiàn)象，也稱為轉(zhuǎn)錄后基因沉默(posttranscriptional gene silencing，PTGS)，是生物體針對外來轉(zhuǎn)座子和病毒感染進化形成的一種古老而保守的防御機制。在哺乳動物系統(tǒng)中，短至21-～23-nt的雙鏈RNA可以作為小干擾RNA(small interfering RNA，siRNA)分子在宿主細胞內(nèi)快速、高效、特異地引發(fā)外源或內(nèi)源性靶mRNA的降解，進而抑制相應基因的表達，卻不引起非特異性干擾素應答。這一重大發(fā)現(xiàn)使得RNA干擾技術迅速發(fā)展成為當今抗病毒、抗腫瘤和蛋白功能分析的有利工具。然而siRNA的有效性高度依賴其靶RNA的特殊位點，盡管在設計siRNA位點時已有一些可供遵循的原則，但這些候選的siRNA最終仍然需要通過大量耗時費力的實驗加以驗證和篩選，因此建立高效、經(jīng)濟快速篩選獲取有效siRNA的方法對RNAi技術的開展應用具有重要的實際意義。 良好的篩選體系首先取決于快速、經(jīng)濟地獲取siRNA的方法�；瘜W合成siRNA成本太高，體外轉(zhuǎn)錄生物合成的方法在RNA操作上較困難，而載體表達方法在載體構(gòu)建時又較繁瑣耗時。相比而言，直接采用PCR制備siRNA或shRNA表達框(siRNA expression cassettes， 浙江人學!刃卜學位價氣沁 SEC)的方法則以其經(jīng)濟、快捷的優(yōu)勢而成為篩選siRNA及其最適搭配啟動子非常有效的__l: 具。通常SEC包含一個RNA聚合酶啟動子、一段shRNA編碼片斷和一個RNA聚合酶終!卜 序列。為避開含有二級結(jié)構(gòu)shONA擴增困難的問題，一般采川兩步PCR反應，但是這種方 法可能會因兩次PCR反應而增加堿基錯摻率，從而影響.高度序列特異的RNAi效應。因此， 在本研究第一部分著重探索建立簡單高效的重疊延伸一步PCR方法，以能夠保質(zhì)保星地構(gòu)建 和擴增sEC，少t以增強刑綠色熒光蛋自(enllaneed green fluoreseence protein，EoFp)作為靶 基因，證實PCR制備的SEC用于瞬時RNAi效應研究及有效siRNA篩選的可行性。 人規(guī)模siRNA篩選_「作還取決于簡便易行、快速準確的效應報告系統(tǒng)。目前應用最為，’‘ 泛的是熒光蛋白，它通過易T-檢測的熒光表達來反映與之融合的目標基因表達情況。以此建 立的致病基因表達報告系統(tǒng)，使包括siRNA在內(nèi)各種墓因治療方法的效果評估變得方便而高 效。在本研究第二部分，我們即以增強型綠色熒光蛋rl(enhaneed green fluoreseent protein， EGFP)作為報告分子建立HBx瞬時表達的快速報告系統(tǒng)，Jt運川第一部分介紹的重疊延伸一 步PcR法制備針對細胞外源致病基因l一IBx的ShRNA表達框，初步建立了HBx一siRNA快速篩 選體系，將從該體系篩選到的最佳SEC再用J飛穩(wěn)定表達Fll3v的2.2.15細胞，做進一步驗證 及抗HBV的效果評價。 機體內(nèi)病毒感染的建立取決于病毒和宿土兩方面因素，病毒在其各個生活周期中都需要 諸多細胞蛋自功能的輔助和參與。近年研究發(fā)現(xiàn)La蛋自是HBV RNA的一個重要穩(wěn)定因子， 即結(jié)構(gòu)功能完披的小鼠La蛋白能夠與HBv RNA的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控序列(HBv pesttranscriPtional regulato叮ele，nent，，HpRE)結(jié)合，保護存在T. 1 IBv RNAJ二(tJ核酸內(nèi)tjJ醉切冉IJ位點.使之免遭 核內(nèi)核酸酶的降解，從而在細胞核內(nèi)發(fā)揮穩(wěn)定}IBV RNA的玉妥作用。最近有研究報道體外表 達人La蛋自(human La protein，hLa)也可以與日PRE高親不11力、特異性結(jié)合，提示人La蛋 自也可以與也HBV RNA相互作用，但是否直接參與11日v RNA代謝尚不消楚.本研究第二部 分即乍{對細胞內(nèi)源性基因La蛋自，繼續(xù)采川SEC介導RNAi的方法，以穩(wěn)定產(chǎn)生HBV的2.2.15 細胞為實驗模型，研究人La蛋自功能與HBV基因表達變化的關系，進而探討人La蛋自在 HBV RNA代謝表達過程中可能的作用，以及將人La蛋自視為宿上共因子川T-抗日BV治療靶 標的可行性。 浙江人學協(xié)卜學位論文 第一部分:shRNA表達框快速制備方法的建立 方法和結(jié)果: 1.重疊延伸一步PcR制備u6+l、Hl、tRNAval三種啟動子一sllRNA表達框首先通過PcR 方法制備含有兩端相同添加接頭的二種RNA多聚酶川(RNA polymerase 111，RNA po，川) 啟動子(u6+I、Hl和tRNAVal) PcR引物通川型模板，再設計合成末端延長的3’端長片 段基因特異性延伸引物(包含shRNA編碼序列和RNA pol川轉(zhuǎn)錄終lr.序列)、及上游和 下游通用引物。用上述模板和引物經(jīng)重疊延伸一步1’、.、又應即可一次性快速、簡捷地獲 得結(jié)構(gòu)完整、產(chǎn)物條帶單一的三種RNA pol 111一sEC。 2.驗證SEC介導的RNAi效應及SEC策略篩選有效siRNA的可行性將針對EGFP兩處 siRNA位點的SEC與表達質(zhì)粒pEGFP一NI共轉(zhuǎn)染日叩GZ細胞，通過熒光顯微鏡、流式細 胞儀和半定量R不PCR檢測分析SEC對EGFP蛋自和mRNA表達的抑制效果。結(jié)果證實 T文獻報道的siEoFp244有效性，t朋^val不一
【圖文】：

圖I-I):為含有U6snR1Va多

PAYUGa27質(zhì)牡田
【學位授予單位】：浙江大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2004
【分類號】：R346

【共引文獻】

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本文編號：2602515