發(fā)布時(shí)間：2020-03-21 15:51

【摘要】：γδT細(xì)胞能夠以主要組織相容性復(fù)合體(major histocompatibility complex, MHC)非限制性方式識(shí)別多種腫瘤相關(guān)抗原,有效的殺傷腫瘤細(xì)胞,并能分泌干擾素(interferon, IFN)-γ等細(xì)胞因子。因此,γδT細(xì)胞已成為當(dāng)前惡性腫瘤免疫治療中一種很有前景的候選細(xì)胞。 γδT細(xì)胞表面除表達(dá)γ和δ鏈組成的T細(xì)胞受體(T cell receptor γδ, TCRγδ)外,還表達(dá)自然殺傷(natural killer, NK)細(xì)胞的重要功能受體NKG2D。這兩種受體分子在γδT細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷中發(fā)揮重要的作用。目前,大部分文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)傾向于γδT細(xì)胞活化為T(mén)CRγδ依賴(lài)性的,而NKG2D僅起共刺激作用。然而,為什么單獨(dú)的TCRγδ刺激即可活化γδT細(xì)胞,NKG2D的共刺激作用又是如何發(fā)揮的?只有進(jìn)一步回答這些問(wèn)題,才能澄清γδT細(xì)胞生物學(xué)效應(yīng)(主要為細(xì)胞毒效應(yīng))的分子機(jī)制,尤其是信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制。 鑒此,本研究主要針對(duì)以下三個(gè)科學(xué)問(wèn)題展開(kāi)：一是γδT細(xì)胞殺傷腫瘤細(xì)胞的主要效應(yīng)途徑是什么?二是TCRγδ和NKG2D在活化γδT細(xì)胞殺傷功能中的具體作用是什么?三是γδT細(xì)胞殺傷功能活化的調(diào)控機(jī)制是什么?本文分以下兩部分就上述三個(gè)科學(xué)問(wèn)題進(jìn)行研究。 第一部分工作旨在進(jìn)一步澄清γδT細(xì)胞殺傷腫瘤細(xì)胞的相關(guān)機(jī)理。首先,我們比較了穿孔素-顆粒酶和Fas-FasL兩條途徑在γδ T細(xì)胞殺傷腫瘤細(xì)胞中的貢獻(xiàn)。我們選取了五種不同組織來(lái)源的腫瘤細(xì)胞作為γδT細(xì)胞殺傷途徑研究的靶細(xì)胞,包括Daudi(人Burkkit淋巴瘤細(xì)胞)、G401(人腎癌Wilms細(xì)胞)、NCI-H446(人小細(xì)胞肺癌細(xì)胞)、HR8348(人結(jié)直腸癌細(xì)胞)和MGC-803(人胃癌細(xì)胞)。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果表明,這五種不同組織來(lái)源的腫瘤細(xì)胞表面Fas受體呈現(xiàn)不同程度的表達(dá)：Daudi為5.14%、G401為7.24%、NCI-H556為44.10%、HR8348為69.40%以及MGC-803為82.30%。然后,對(duì)這五種Fas受體表達(dá)水平不同的腫瘤細(xì)胞進(jìn)行穿孔素-顆粒酶途徑及Fas-FasL途徑的封閉實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明,封閉穿孔素-顆粒酶途徑后,γδT細(xì)胞對(duì)這五種腫瘤細(xì)胞的殺傷能力均顯著降低,而封閉Fas-FasL途徑對(duì)γδT細(xì)胞殺傷能力無(wú)顯著影響。隨后的酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)結(jié)果顯示,穿孔素-顆粒酶途徑封閉的γδT細(xì)胞與靶細(xì)胞共孵育后分泌IFN-γ的能力亦顯著降低。而Fas-FasL途徑封閉后,γδT細(xì)胞分泌IFN-y的能力無(wú)顯著變化。以上結(jié)果表明γδT細(xì)胞殺傷腫瘤細(xì)胞的主要途徑為穿孔素-顆粒酶途徑。 隨后,利用激活抗體包被的P815靶細(xì)胞殺傷體系,探討了TCRγδ和NKG2D在活化γδT細(xì)胞殺傷功能中的作用,并分析了二者功能存在差異的原因。P815靶細(xì)胞殺傷實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,單獨(dú)給予抗TCRγδ抗體刺激即可活化γδT細(xì)胞,殺傷抗體包被的P815靶細(xì)胞,并分泌IFN-γ;而單獨(dú)的抗NKG2D抗體刺激卻不能活化γδT細(xì)胞的殺傷功能,也不能引起IFN-γ的分泌。然而,抗NKG2D抗體可以增強(qiáng)抗TCRγδ抗體刺激所引起的γδT細(xì)胞的殺傷功能和分泌IFN-γ的能力。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果表明,抗TCRγδ抗體和抗NKG2D抗體均可引起γδT細(xì)胞的脫顆粒反應(yīng)；激光共聚焦檢測(cè)結(jié)果表明,單獨(dú)的抗TCRγδ抗體刺激即可引起γδT細(xì)胞裂解性顆粒的極化,單獨(dú)的抗NKG2D抗體刺激卻不能。盡管如此,抗NKG2D抗體可以在某種程度上增強(qiáng)抗TCRγδ抗體所引起的裂解性顆粒極化。結(jié)合殺傷實(shí)驗(yàn)結(jié)果,提示引起γδT細(xì)胞裂解性顆粒極化能力的不同是TCRγδ和NKG2D在活化γδT細(xì)胞殺傷功能方面存在功能差異的主要原因。 第二部分研究工作旨在明確調(diào)控γδT細(xì)胞殺傷功能活化的相關(guān)信號(hào)通路。首先對(duì)γδT細(xì)胞殺傷功能相關(guān)的活化信號(hào)通路進(jìn)行了研究,主要集中在Vavl信號(hào)通路、磷酸脂酶C-γ1(Phospholipase C-γ1, PLC-γ1)信號(hào)通路、絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)/細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(extracellular signal-regulated kinase, Erk)信號(hào)通路、磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol3-kinase, PI3K)信號(hào)通路等四條與αβ T細(xì)胞和NK細(xì)胞活化相關(guān)的信號(hào)通路。運(yùn)用Western blot技術(shù),證實(shí)了單獨(dú)的抗TCRγδ抗體刺激即可顯著性活化Vav1信號(hào)通路、PLC-γ1信號(hào)通路以及Erk信號(hào)通路；而單獨(dú)給予抗NKG2D抗體刺激則無(wú)此作用；在聯(lián)合給予抗NKG2D抗體刺激時(shí),這三條信號(hào)通路的活化顯著增強(qiáng)。PI3K信號(hào)通路在給予抗TCRγδ抗體刺激或抗NKG2D抗體刺激時(shí)均明顯活化,而聯(lián)合給予二者刺激時(shí),PI3K信號(hào)通路活化亦未見(jiàn)增強(qiáng)。結(jié)合殺傷實(shí)驗(yàn)結(jié)果,提示Vav1信號(hào)通路、PLC-γ1信號(hào)通路以及Erk信號(hào)通路與γδT細(xì)胞殺傷功能密切相關(guān)。利用siRNA技術(shù)敲低γδT細(xì)胞內(nèi)的Vav1分子表達(dá)時(shí),發(fā)現(xiàn)γδT細(xì)胞對(duì)靶細(xì)胞的殺傷、IFN-γ分泌以及裂解性顆粒極化能力均顯著降低；同時(shí),敲低Vavl亦可顯著抑制PLC-γ1信號(hào)通路以及Erk信號(hào)通路的活化。利用信號(hào)通路抑制劑抑制γδT細(xì)胞內(nèi)的PLC-γ1信號(hào)通路以及Erk信號(hào)通路時(shí),發(fā)現(xiàn)抑制PLC-γ1信號(hào)通路可顯著抑制γδT細(xì)胞的殺傷、IFN-γ分泌以及裂解性顆粒極化,而抑制Erk信號(hào)通路對(duì)γδT細(xì)胞的殺傷功能及裂解性顆粒極化均無(wú)顯著影響,但抑制Erk信號(hào)通路可抑制γδT細(xì)胞IFN-γ的分泌。此外,抑制PLC-γ1信號(hào)通路可顯著抑制γδT細(xì)胞內(nèi)Erk信號(hào)通路的活化。上述結(jié)果提示,Vav1-PLC-γ1信號(hào)通路位于Erk信號(hào)通路上游,并在γδT細(xì)胞殺傷功能活化中具有重要的作用。 隨后的研究工作證實(shí)了Cbl-b在γδT細(xì)胞殺傷功能活化中的負(fù)調(diào)控作用。利用siRNA技術(shù)敲低γδT細(xì)胞內(nèi)Cbl-b分子表達(dá)時(shí),γδT細(xì)胞對(duì)靶細(xì)胞的殺傷能力、殺傷功能相關(guān)的Vav1-PLC-γ1信號(hào)通路活化以及裂解性顆粒極化均顯著提高；特別值得一提的是,單獨(dú)的抗NKG2D抗體刺激即可活化與γδT細(xì)胞的殺傷功能相關(guān)的Vav1-PLC-γ1信號(hào)通路,并引起裂解性顆粒極化,提示Cbl-b是單獨(dú)使用抗NKG2D抗體不能活化γδT細(xì)胞殺傷功能的主要負(fù)調(diào)控因素,亦提示γδT細(xì)胞殺傷功能活化需要一個(gè)較強(qiáng)的活化信號(hào)來(lái)克服活化抑制信號(hào)；Vav1過(guò)表達(dá)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)了這一點(diǎn)。此外,RNAi實(shí)驗(yàn)也證實(shí)了Cbl-b是通過(guò)抑制Vavl磷酸化而發(fā)揮其負(fù)調(diào)控功能的。 綜上所述,本研究得出以下主要結(jié)論：1、γδT細(xì)胞殺傷靶細(xì)胞主要通過(guò)穿孔素-顆粒酶途徑；2、γδT細(xì)胞殺傷功能為T(mén)CRγδ依賴(lài)性的,NKG2D可增強(qiáng)TCRγδ依賴(lài)性的γδT細(xì)胞殺傷功能；3、引起裂解性顆粒極化能力的不同是TCRγδ和NKG2D在活化γδT細(xì)胞殺傷功能方面存在差別的原因；4、Vav1-PLC-γ1信號(hào)通路與γδT細(xì)胞殺傷功能密切相關(guān)；5、Cbl-b負(fù)調(diào)控γδT細(xì)胞殺傷功能；6、γδT細(xì)胞殺傷功能的活化需要一個(gè)較強(qiáng)的活化信號(hào)來(lái)克服活化抑制信號(hào),最終使γδT細(xì)胞發(fā)揮殺傷能力。本研究深入揭示了TCR依賴(lài)性γδT細(xì)胞殺傷活性的分子機(jī)制,發(fā)現(xiàn)γδT細(xì)胞殺傷功能的實(shí)現(xiàn)需要經(jīng)Vav1-PLC-γ1信號(hào)通路的活化來(lái)消除E3泛素連接酶Cbl-b的抑制作用,為深入闡明γδT細(xì)胞生物學(xué)效應(yīng)的作用機(jī)制提供了研究資料。
【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類(lèi)號(hào)】：R392

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2593565