【摘要】： 本博士論文工作的主要貢獻為發(fā)展了蛋白質(zhì)凝膠內(nèi)酶切方法以及膠內(nèi)酶切產(chǎn)物的在線預(yù)濃縮技術(shù)；另外對新型介孔無機材料在MALDI中的應(yīng)用也進行了研究；利用基于雙向電泳和生物質(zhì)譜的方法策略對缺血心肌線粒體以及高、低轉(zhuǎn)移潛能肝癌組織進行了差異蛋白質(zhì)組分析。 后基因組學(xué)的主要流派蛋白質(zhì)組學(xué)目前顯得相當(dāng)活躍。蛋白質(zhì)組學(xué)分離和分析細胞與組織的全部蛋白并直接找到一組或幾組功能蛋白，并研究它們與功能基因(組)的內(nèi)在聯(lián)系 。在目前功能基因尚不很清楚的情況下，直接發(fā)現(xiàn)功能蛋白組具有重要的意義。目前，蛋白質(zhì)組學(xué)的研究主要集中在通過對蛋白質(zhì)性質(zhì)、豐度的考察來揭示它的功能，進而找到與人類重大疾病相關(guān)的差異蛋白，使之成為藥物篩選的靶分子，，指導(dǎo)基因組的分析，而不是僅僅尾隨DNA序列分析的結(jié)果。 蛋白質(zhì)組學(xué)也正在成為分析化學(xué)研究領(lǐng)域的最前沿研究而蛋白質(zhì)組學(xué)的科學(xué)研究之所以能夠取得蓬勃的發(fā)展，主要依賴于高通量分離和分析技術(shù)的突破性進步。首先是雙向凝膠電泳技術(shù)的完善，使得蛋白質(zhì)的大范圍、高通量分析成為可能。其次是質(zhì)譜技術(shù)尤其是軟電離技術(shù)的發(fā)展，使之成為檢測蛋白質(zhì)分子的重要手段。最后是生物信息學(xué)的建立使得國際性的科學(xué)大協(xié)作得以形成。目前，世界各主要國家都不惜巨資進行蛋白質(zhì)組的研究。蛋白質(zhì)組學(xué)研究的進一步深入，將對了解疾病的發(fā)生和藥物的篩選起到?jīng)Q定性的作用。 本論文工作包括兩個部分：第一部分為蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)平臺的建立與發(fā)展，建立了基于雙向電泳和質(zhì)譜的蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)平臺，對膠內(nèi)酶解方法以及其濃縮方法進行了改進和發(fā)展，并對無機MALDI基質(zhì)作了初步研究。第二部分為疾病比較蛋白質(zhì)組初探，利用基于雙向電泳和生物質(zhì)譜的方法策略對缺血心肌線粒體以及高、低轉(zhuǎn)移潛能肝癌組織進行了比較蛋白質(zhì)組分析。 第一部分 蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)平臺的建立與發(fā)展 聚丙烯酰胺凝膠電泳，包括一維和二維，是目前蛋白質(zhì)研究中用來分離復(fù)雜蛋白體系的最重要的手段。而對膠上蛋白進行膠內(nèi)酶解以及質(zhì)譜分析，也已經(jīng)成為復(fù)雜體系中蛋白鑒定的最常用的方法。由于考馬斯亮藍的存在會影響酶解反應(yīng)，所有現(xiàn)有的膠內(nèi)酶解方法都要求在酶解反應(yīng)之前徹底除去凝膠中的考馬斯亮藍。這個過程增加了工作量，耗時而且會造成蛋白丟失，影響蛋白鑒定的靈敏度。本工作提出了一種簡化的膠內(nèi)酶解方法，在酶解前不需除去考馬斯亮藍。利用簡 WP=7 化方法對500 ng BSA 進行酶解，并用HPLC/ESIMS進行分析。結(jié)果表明使用簡化方法時酶解仍然可以有效進行。另外，考馬斯亮藍在反相HPLC中有強保留，不會與肽段同時洗脫，所以不會對HPLC-ESIMS分析造成干擾。利用一系列不同上樣量的馬心肌紅蛋白對簡化方法與傳統(tǒng)方法進行了比較，發(fā)現(xiàn)簡化方法傾向于產(chǎn)生更多的胰蛋白酶漏切位點，并可以因此提高序列覆蓋率。對簡化方法在MALDI-TOFMS上的適用性進行了驗證，在用ZipTip脫鹽時使用33%的乙腈洗脫以防止考馬斯亮藍與肽段同時洗脫。50 ng BSA 可以得到令人滿意的結(jié)果，顯示了簡化的方法可方便地用于MALDI-TOFMS檢測，并擁有足夠的靈敏度。用該方法對大鼠心肌線粒體蛋白雙向電泳圖上的兩個蛋白點進行了成功鑒定，表明簡化方法完全可以適用于實際生物樣品的分析。 在膠內(nèi)酶解產(chǎn)物的質(zhì)譜鑒定前，通常需對樣品進行濃縮。常規(guī)的濃縮方法費時費力，而且會由于容器表面吸附造成大量樣品損失。本論文發(fā)展了一種基于強陽離子交換色譜(SCX)的凝膠內(nèi)酶切產(chǎn)物的在線預(yù)濃縮方法，可以方便地應(yīng)用于蛋白的LC-ESIMS分析。由于膠內(nèi)酶解肽段的提取液（5% FA或TFA/50%乙腈）恰好與SCX肽段吸附的條件相吻合，因此肽段提取液可以不經(jīng)過任何處理直接用SCX 柱濃縮，然后用1 M 醋酸銨溶液將吸附的肽段洗脫進入反相LC-MS系統(tǒng)進行分析。獨特設(shè)計的預(yù)濃縮/分析體系利用兩個六通閥將SCX和反相色譜相連，可以很方便地實現(xiàn)30倍的在線預(yù)濃縮。利用100 ng 的膠內(nèi)牛血清蛋白對該方法進行了驗證，與傳統(tǒng)的濃縮方法相比，該方法可以獲得9個肽段，而傳統(tǒng)的冷凍抽干方法僅得到5個。其原因有兩點：（1）新方法可以大大減少傳統(tǒng)方法的樣品干燥和轉(zhuǎn)移過程中由于容器表面吸附引起的損失。（2）在SCX濃縮過程中，可以除去樣品中的非離子性雜質(zhì)，有利于改善樣品峰的信噪比。另外，該方法具有省時、裝置簡單、易于自動化和有利于反相色譜柱的保護等優(yōu)點。 有機基質(zhì)的出現(xiàn)大大推動了基質(zhì)輔助激光解析電離質(zhì)譜（MALDI-MS）在生物大分子分析中的應(yīng)用。然而有機基質(zhì)自身電離會在質(zhì)譜的低質(zhì)量范圍產(chǎn)生背景，影響MALDI-MS對小分子的分析。雖然有人研究了利用無機材料作為MALDI基質(zhì)的可能性，但其靈敏度非常低。本論文研究了一系列無機介孔材料（TiO2, CeTiO, ZrTiO, TiSiO, ZrO2, AlTiO, AlSiO和SiO2）作為MALDI基質(zhì)的可能性。樣品為PPG（分子量范圍500 至3000 Da）和一個標(biāo)準(zhǔn)肽（分子量980 Da）。被測材料對分析物的電離能力表現(xiàn)出極大差異，TiO2 和CeTiO 靈敏度最高，ZrTiO, TiSiO, ZrO2, AlTiO 和AlSiO 的電離能力低得多，而SiO2無法使樣品電離。其該結(jié)果提示材料的靈敏度與UV吸收正相關(guān)。被分析物通常以鉀離子加合物的形式電離，偶見鈉離子加合
【圖文】：

Fig. 4 UV absorption of different materials從我們的實驗結(jié)果來看，材料的紫外強吸收是其能夠作為 MALDI 基質(zhì)的必要條件。圖 4 是各種材料的紫外吸收光譜。從圖 4 可看到，各種材料在 337 nm 處的紫外吸收強度從大到小依次為CeTiO, TiO2, TiPO, ZrO2, AlTiO, TiZrO, TiSiO。該次序與圖 1 中各材料對應(yīng)的質(zhì)譜圖強度基本一致。樣品的質(zhì)譜峰強度似與基質(zhì)的紫外吸收能力正相關(guān)。從目前廣泛認(rèn)可的 MALDI 機理來說，這種結(jié)果也是合乎情理的。因為基質(zhì)首先必須要吸收激光的能量才有可能將能量轉(zhuǎn)移至樣品以使其離子化。這也提示我們可以用材料的紫外吸收性質(zhì)來進行無機基質(zhì)篩選。值得注意的是無紫外吸收的 SiO2在本實驗中未得到任何信號，這與一部分文獻報道[12]吻合而與另一些文獻[13，14]相左，其原因可能是某些文獻中所使用的材料純度不夠高。3.3 CeTiO 基質(zhì)的耐鹽性
【學(xué)位授予單位】：復(fù)旦大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2003
【分類號】：R341;O657.63

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本文編號：2592217