【摘要】：葡萄球菌腸毒素（Staphyloccucal enterotoxins,SEs）是由葡萄球菌分泌的細(xì)菌外毒素，目前已報道的有SEA、SEB、SEC1-3、SED、SEE、SEF、SEG等二十多種血清型，共稱為葡萄球菌SE類超抗原，是細(xì)菌性食物中毒、化膿性感染、院內(nèi)感染的重要毒素。 作為一類超抗原，通過橋聯(lián)結(jié)合抗原提呈細(xì)胞上的MHC II類分子和TCR的β鏈V區(qū)，形成MHC II類分子:SEs:TCR的三元復(fù)合物，直接激活T淋巴細(xì)胞，并導(dǎo)致一系列炎癥細(xì)胞因子的釋放，從而引起高熱、惡心、腹瀉及毒素休克綜合征（TSS）。由金黃色葡萄球菌腸毒素B(SEB)引起的TSS的病死率可達(dá)50%，與流感并發(fā)的SEB感染的死亡率更高達(dá)90%以上，因此SEB被美國特殊作戰(zhàn)處列為常規(guī)儲存的"標(biāo)準(zhǔn)"（"經(jīng)典"）生物戰(zhàn)劑。 目前臨床上尚無針對SEB中毒的有效疫苗和藥物，而治療性單克隆抗體因其具有高特異性和低毒副作用的特性，常在SEB的防治過程中被列為首選方案。國內(nèi)外的多個研究小組也獲得了一些鼠源抗SEB的中和性單克隆抗體，但只能達(dá)到部分的中和保護(hù)效果（63%），其對SEB誘導(dǎo)的T淋巴細(xì)胞激活的抑制作用也僅為50-75%；說明單一的單克隆抗體并非是超抗原家族致病過程最理想的抑制劑。而多種中和性抗體的聯(lián)合應(yīng)用，雖可實現(xiàn)理想的協(xié)同作用，但由于其成分相對復(fù)雜、在藥效學(xué)評價方面需多次進(jìn)行臨床實驗等因素，限制了推廣和應(yīng)用。此外，由于多數(shù)中和性抗體的結(jié)合表位不明確，抗體的中和保護(hù)機(jī)制尚不明了，使研究難以有突破性進(jìn)展，因此篩選中和保護(hù)性抗體、確定其結(jié)合表位，明確其中和保護(hù)的作用機(jī)制對于研制SEB的治療性抗體具有十分重要的意義。 本項研究旨在利用本實驗室已獲得的具有中和保護(hù)作用抗SEB的單克隆抗體的前提下，進(jìn)一步通過鼠源3E2與SEB的共結(jié)晶，解析了SEB與中和保護(hù)抗體的作用界面，明確了SEB與鼠源3E2抗體結(jié)合表位的關(guān)鍵位點(diǎn)，初步闡明其中和保護(hù)作用的機(jī)制；進(jìn)一步采用基因工程方法構(gòu)建高效的雙可變區(qū)（DVD）可同時中和SEB MHC和TCR結(jié)合位點(diǎn)的中和性抗體3E2-4A3，研究主要包括三個部分： 一、抗SEB中和保護(hù)性抗體的作用及其結(jié)構(gòu)基礎(chǔ) 在前期的研究中，我們通過大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)融合表達(dá)了GST-SEB蛋白，免疫Balb/C小鼠后，采用雜交瘤技術(shù)制備了10株具有中和保護(hù)作用的鼠源性單克隆抗體，并采用噬菌體12肽庫表位淘選了其中具有較高結(jié)合力的四株抗體，初步確定了m4A3、m3C1結(jié)合于SEB的TCR功能域，m3E2抗體結(jié)合于SEB的MHC II類分子功能域，m1A5結(jié)合于MHC II類分子功能域的附近。m3E2抗體的親和力略高于其它三株。 為了進(jìn)一步確定m3E2抗體的中和保護(hù)作用的中和表位，我們將m3E2抗體與SEB做了共結(jié)晶，通過解析發(fā)現(xiàn)m3E2抗體主要結(jié)合于SEB MHC II類分子的結(jié)合功能域44FLYF47和71KDLADK76。我們將這幾處位置的氨基酸做了定點(diǎn)突變并在大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)了突變體蛋白，通過ELISA、Western blot、3H增殖實驗及體外抑制細(xì)胞因子釋放實驗，證實SEB46Y和71K為m3E2與其結(jié)合的關(guān)鍵氨基酸。進(jìn)一步我們分別將46Y突變成E/F/L/M，將71K突變成N/Q/R，通過Biacore測定其親和力，結(jié)果發(fā)現(xiàn)當(dāng)46Y突變成E（谷氨酸）、Q（谷氨酰胺）時，SEB與m3E2不結(jié)合；當(dāng)突變成F（苯丙氨酸）、M（甲硫氨酸）和R(精氨酸)時，親和力基本無變化，提示局部維持疏水環(huán)境對維護(hù)m3E2與SEB的緊密結(jié)合具有重要作用；而當(dāng)71K突變成L（亮氨酸）、N（天冬氨酸）時，親和力分別由原來的5.7E-10下降至3.14E-8和1.41E-6。46Y的突變結(jié)果提示局部維持疏水環(huán)境對維護(hù)m3E2與SEB的緊密結(jié)合具有重要作用，71K的突變結(jié)果說明局部正電荷環(huán)境對抗原抗體間的親和力變化具有重要的意義。 二、抗SEB中和保護(hù)性抗體的協(xié)同作用 為了探討鼠源抗SEB中和保護(hù)性抗體的協(xié)同作用，我們將m3E2與其他三株中和保護(hù)性抗體進(jìn)行了組合分組，通過3H增殖實驗和體外抑制細(xì)胞因子釋放實驗發(fā)現(xiàn)，m3E2+m4A3聯(lián)合應(yīng)用對T細(xì)胞增殖的抑制作用達(dá)到73%，m3E2+m3C1的抑制效率為68%，而單用這三株抗體的抑制率平均在60%左右；m3E2+m4A3聯(lián)合應(yīng)用對細(xì)胞因子IL-2、INF-γ、TNF-α釋放的抑制作用分別達(dá)到67.4%、68.8%和69%，m3E2+m3C1組的抑制效率為59.7%、64%、61.4%，而它們單用的抑制率平均僅有40%左右，表明m3E2+m4A3和m3E2+m3C1這兩組針對SEB不同功能域的抗體聯(lián)合應(yīng)用具有協(xié)同作用，且m3E2+m4A3聯(lián)合應(yīng)用的效果明顯優(yōu)于m3E2+m3C1。而其它幾組針對SEB相同功能域的抗體聯(lián)合應(yīng)用后，T細(xì)胞增殖的抑制率在50%左右，對細(xì)胞因子釋放的抑制作用僅在32%左右，說明聯(lián)合應(yīng)用不同功能域的抗體，對SEB的中和保護(hù)作用具有協(xié)同作用，而相同功能域的協(xié)同作用不顯著。 三、高效抗SEB雙可變區(qū)抗體的構(gòu)建及功能鑒定 采用基因工程技術(shù)，構(gòu)建了兩種結(jié)構(gòu)的DVD抗體3E2-4A3和4A3-3E2，共轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞，瞬轉(zhuǎn)結(jié)果顯示，DVD3E2-4A3的結(jié)合活性要優(yōu)于DVD4A3-3E2。體內(nèi)外實驗證明，DVD3E2-4A3抗體的體內(nèi)外中和活性均強(qiáng)于單個親源抗體。同時發(fā)現(xiàn)DVD抗體較單個親源抗體具有更高的親和力（10倍），說明其高效的優(yōu)勢不僅是通過對MHCII和TCR功能域的雙阻斷，而且由于其更高的親和力，實現(xiàn)了對SEB的高效的中和保護(hù)作用。 本研究在前期獲得了10株SEB特異性單克隆抗體的基礎(chǔ)上，通過m3E2和SEB蛋白的共結(jié)晶，解析了SEB與抗體的作用界面，通過定點(diǎn)突變證實SEB46Y和71K為m3E2與其結(jié)合的關(guān)鍵氨基酸，探討了抗SEB抗體中和保護(hù)作用的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)；進(jìn)一步比較了幾株中和保護(hù)性抗體的協(xié)同作用，發(fā)現(xiàn)針對不同功能域的抗體之間具有協(xié)同作用，而同一功能域的中和保護(hù)性抗體的協(xié)同作用不顯著；在此基礎(chǔ)上，構(gòu)建獲得了可同時結(jié)合SEB TCR和MHCII不同功能域的高效雙可變區(qū)抗體DVD3E2-4A3，并證實其中和保護(hù)作用優(yōu)于雙抗體的聯(lián)合使用。針對雙功能表位的雙可變區(qū)抗體可能成為抗SEB的新的治療策略，為研制抗SEB新型抗體類藥物作出了探索。
【圖文】：

水、灰塵都可找到。金葡菌所引起的疾病，最常見的有三大類：染，毛囊炎、癤子、嚴(yán)重者可引起敗血癥、腦膜炎、骨髓感染等染，通過污染的器械用品造成傷口化膿感染，注射部位化膿感染，等癥；三是由金黃色葡萄球菌腸毒素引起食物中毒。在美國由腸毒占整個細(xì)菌性食物中毒 33%，而在加拿大更是高達(dá) 45%，我國每事件也非常多。球菌腸毒素（SEs）是一類由革蘭氏陽性細(xì)菌葡萄球菌不同菌株分素，目前已報道的大約有二十多種血清型[1-8]，其中金黃色葡萄球因其超抗原的特性以及在中毒性休克綜合征發(fā)病中的特殊意義而倍序列與 SEC 和毒素休克綜合征毒素（TSST-1）40-60%同源，根據(jù)氨子量約為 28.5kD，為一單鏈多肽，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)由 5 個 α 螺旋（圖組成 2 個區(qū)[10、11]，SEB 與 MHCII 結(jié)合的區(qū)域位于 α 螺旋 5 和 β 片SEB 的 T 細(xì)胞受體（TCR）結(jié)合區(qū)位于其頂部的四個不同區(qū)域：α3 的環(huán)部；β 片層 4 的尾部和 β 片層與 α 螺旋 5 的環(huán)部[13]。

圖 2 SEB 作用機(jī)制 外中毒性休克綜合征的主要致病毒素。0.004μg/kg 的劑量即可g/kg 的劑量則可引起死亡[17]。人體感染 SEB 后，可引起呼吸困成發(fā)熱、肺水腫、急性呼吸窘迫癥、中毒性休克、多臟器的衰，SEB 也可造成皮膚炎、慢性鼻炎、哮喘等，，其發(fā)病機(jī)制與 SE反應(yīng)相關(guān)[19-22]。對 SEB 誘導(dǎo)的中毒性休克綜合征尚無非常有效的防治手段，IVIG）可減輕 SEB 誘導(dǎo)的炎性疾病的癥狀[23]。有研究者將一體用于防治小鼠或靈長類動物模型中 SEB 誘導(dǎo)的致死性休克（淋巴細(xì)胞活化后細(xì)胞因子的釋放[24、25]。多個研究小組也已證實 具有一定的中和保護(hù)作用[26-30]，且抗體滴度的高低跟中和保護(hù)究者用識別SEB MHCII或TCR Vβ結(jié)合位點(diǎn)的小分子片段來制
【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R392

【參考文獻(xiàn)】

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1 陳立杰;劉振世;董邦權(quán);楊琨;李琦;金伯泉;;酶聯(lián)免疫發(fā)光法檢測金葡菌腸毒素(SE)B和SEC1方法的建立[J];細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志;2006年05期

2 邱陽,王剛,盧行安;PCR技術(shù)檢測食品中金黃色葡萄球菌腸毒素B基因[J];中國微生態(tài)學(xué)雜志;2004年02期

3 韓云坤;孫冰;李麗紅;孫利煒;;川崎病T細(xì)胞免疫及細(xì)胞因子變化的研究[J];中國實驗診斷學(xué);2011年09期

本文編號：2591867