【摘要】： 目的: 體外原核表達小鼠糖皮質激素誘導的腫瘤壞死因子受體家族相關配體(glucocorticoid-induced TNFR-related protein ligand,GITRL)蛋白,制備小鼠GITRL(mGITRL)多克隆抗體;體內外研究mGITRL對小鼠Th17細胞產(chǎn)生的影響;建立小鼠膠原誘導性關節(jié)炎(collagen-induced arthritis,CIA)模型,觀察mGITRL對CIA發(fā)病的影響,并尋找其作用機制。 方法: (1)取本室留存的mGITRL-pET-32a-E.coli BL-21菌種,涂板,挑取單個菌落接種于LB培養(yǎng)基中,1 mmol/L的異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropylβ-D-1-thiogalactopyranoside,IPTG)誘導蛋白表達,SDS-PAGE電泳檢測mGITRL融合蛋白的表達情況。通過ProfinityIMAC Nickel柱分離純化目的蛋白,純化蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳鑒定,并通過內毒素去除試劑盒去除蛋白中的內毒素。將純化蛋白與弗氏佐劑乳化后免疫家兔,三次免疫后收集兔血清,ELISA法檢測兔抗小鼠GITRL抗體效價,Western blot檢測抗體特異性。 (2)免疫磁珠法分離正常小鼠脾臟來源的CD4~+T細胞。將mGITRL蛋白及對照蛋白分別加入小鼠CD4~+T細胞的培養(yǎng)體系,在Th17細胞誘導條件下培養(yǎng)96h,通過流式細胞術檢測Th17細胞的比例變化;收集細胞培養(yǎng)上清,ELISA法檢測上清中細胞因子IL-17表達變化。 (3)正常小鼠體內分別注射mGITRL蛋白及對照蛋白,10天后處死小鼠,利用流式細胞術檢測小鼠脾臟中Th17細胞的比例變化及其轉錄因子RORγt的表達情況;ELISA法檢測小鼠血清中IL-17表達水平。 (4)建立小鼠膠原誘導性關節(jié)炎(CIA)模型。尾靜脈分別注射mGITRL蛋白及對照蛋白,觀察小鼠發(fā)病進程(臨床評分,CIA發(fā)病率,病理學檢查);利用流式細胞術檢測小鼠脾臟及引流淋巴結中Th17細胞的比例、數(shù)目變化及其轉錄因子RORγt的表達情況;ELISA法檢測小鼠血清中IL-17表達水平。 結果: (1)攜帶表達載體mGITRL-pET-32a的E.coli BL-21細菌,經(jīng)終濃度為1mmol/L IPTG、30℃誘導6h,其融合蛋白分子量大小約為40KD,純化后目的蛋白純度＞90%;ELISA法檢測兔抗小鼠GITRL抗體效價為1:20000;Western blot檢測結果顯示該抗體能與mGITRL蛋白特異性結合。 (2)免疫磁珠法分離獲得小鼠CD4~+T細胞,純度＞95%。在Th17細胞培養(yǎng)體系中,與對照蛋白相比,mGITRL使CD4~+IL-17~+(Th17)細胞的比例由14.1%上升到16.1%;且隨著mGITRL蛋白濃度增加(0.5、1、5、10μg/ml),Th17細胞的比例由15.81%上升為17.90%,細胞培養(yǎng)上清中分泌的細胞因子IL-17由387.51 pg/ml增加到512.70pg/ml。 (3)在正常小鼠體內,與注射對照蛋白(CTL組)的小鼠比較,注射mGITRL蛋白(GITRL組)的小鼠脾臟中Th17細胞比例增加極顯著(0.86±0.40%vs 1.77±0.49%,p＜0.01);CD4~+RORγt~+T細胞比例顯著性增加(1.21±0.55%vs 1.91±0.60%,p＜0.05);小鼠血清中IL-17含量增高(3.68±1.37 pg/ml vs 6.54±1.32 pg/ml,p＜0.05)。 (4)成功建立小鼠CIA模型。在模型鼠中,對照蛋白(CTL-CIA)組小鼠在第一次免疫后第32天發(fā)病,第46天病情達到高峰,臨床評分達9.1分;目的蛋白(GITRL-CIA)組小鼠,第一次免疫后第28天發(fā)病,第38天病情達到高峰,臨床評分達10.1分。病理學檢查發(fā)現(xiàn),CIA組小鼠及CTL-CIA組小鼠關節(jié)中炎癥細胞浸潤,滑膜增生明顯,未見軟骨損傷;GITRL-CIA組小鼠關節(jié)中除大量浸潤的炎癥細胞和增生的滑膜外,可見明顯血管翳形成和軟骨損傷。流式細胞術檢測發(fā)現(xiàn),與CIA組小鼠(2.49×10~5±9.07×10~4)和CTL-CIA組小鼠(2.07×10~5±7.01×10~4)相比,GITRL-CIA組小鼠引流淋巴結中Th17細胞數(shù)目顯著性增加(2.30×10~6±9.11×10~5),結果具有統(tǒng)計學意義(p＜0.05);同時與CIA組小鼠(8.93±3.20 pg/ml)和CTL-CIA組小鼠(8.15±2.56 pg/ml)相比,GITRL-CIA組小鼠血清中IL-17A的含量顯著性升高(17.59±3.46 pg/ml),結果具有統(tǒng)計學意義(p＜0.05)。 結論: (1)成功表達、純化小鼠GITRL蛋白,并制備其多克隆抗體。 (2)在體外,mGITRL蛋白可促進小鼠Th17細胞的產(chǎn)生,且具有一定濃度依賴性。 (3)在體內,mGITRL蛋白可增加正常小鼠脾臟中Th17細胞的比例,上調RORγt的表達;并促進小鼠血清中IL-17含量增加。 (4)mGITRL蛋白可以加速并加重小鼠CIA的發(fā)病過程,并且這種作用可能與體內Th17細胞的數(shù)目增加、血清中IL-17含量增高有關。
【圖文】：

2.1mGITRL融合蛋白的表達、純化及鑒ion，PurifieationandidentifieationofmProteinafterinduction;laneZ:thebaeteriumblank，nothing;lane4:thePurifiedreeombinaRL多克隆抗體效價和特異性的測定為陰性對照，ELISA法測定兔抗小鼠2.1為判斷指標，結果顯示抗體滴度達顯示，兔抗血清可特異性結合小鼠好的蛋白是研究蛋白功能以及制備抗ProfinityIMAcNickel柱進行蛋白純與融合蛋白上帶有的多聚組氨酸結合，

4.3.2mGITRL可以加重小鼠CIA發(fā)病程度在第一次免疫后第34天，取各組CIA小鼠受累關節(jié)，做病理切片HE染色。在顯微鏡下，我們可以觀察到(圖4.4):CIA組小鼠和CTL一CIA組小鼠關節(jié)腔內有大量炎性細胞浸潤，滑膜細胞增生明顯，并呈粗大絨毛深入關節(jié)腔內，增生滑膜中可偶見血管，但關節(jié)軟骨平滑，尚未發(fā)生損傷;GITRL一CIA組小鼠關節(jié)病變明顯，關節(jié)腔內有大量炎性細胞浸潤，滑膜細胞明顯增生，并伴有血管豁形成(圖片沒有顯示)，偶見軟骨和骨損傷(圖 4.4C，F(xiàn))。病理學評分見圖4.5，圖中水平線代表病理評分平均值，我們可以看到GrrRL一CIA組的平均值高于CIA組以及CTL一CIA組
【學位授予單位】：江蘇大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2010
【分類號】：R392.11

【引證文獻】

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1 汪麗云;GITR信號在ConA誘導的小鼠急性自身免疫性肝損害中的作用[D];華中科技大學;2011年

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本文編號：2577979