【摘要】： 有關(guān)RA治療策略的探索始終是國內(nèi)外尤為關(guān)注的焦點、熱點和難點。由于迄今對于RA的病因認識不清,對其病機了解不深,目前尚無任何特異性根治療法。所使用的藥物與方案也就是非特異性緩解對癥療法,都必然會產(chǎn)生多種多樣的嚴(yán)重毒副作用。因此,如何能發(fā)現(xiàn)或發(fā)明理想、高效、低毒、特異的藥物,使其既能迅速緩解RA的表癥,而且更能有效地針對其病機,選擇性地阻斷其病理生理過程的全新型制劑已是風(fēng)濕學(xué)領(lǐng)域亟待解決的關(guān)鍵首要問題!業(yè)已證明,RA是一種抗原驅(qū)動由CD4+CD28+Th1細胞介導(dǎo)的全身性自身免疫病。鑒于RA病人的滑膜炎癥和關(guān)節(jié)破壞變形與免疫功能的改變密切相關(guān),近年來國外趨向于將對免疫調(diào)節(jié)作用的藥物作為治療RA的第一線藥,并對RA新的免疫治療策略進行了廣泛的研究�！盎蚧駾NA治療性疫苗”就是其中最受重視和最為推崇的一種,它是自二十世紀(jì)九十年代國際上興起治療自身免疫病的特異性免疫療法之一,也是近年來免疫學(xué)研究領(lǐng)域中最活躍、最富有成效的領(lǐng)域之一。 從理論上講,任何能夠有效減少、抑制或阻斷RA病理生理發(fā)生與發(fā)展進程的藥物都能有效減輕或緩解RA的骨關(guān)節(jié)病變。鑒于B7:CD28/CTLA4共刺激信號途徑在其發(fā)生發(fā)展的病理生理過程中發(fā)揮重要作用這一事實,選擇性阻斷B7:CD28/CTLA4共刺激信號途徑誘導(dǎo)免疫耐受已成為有效防治自身免疫性疾病的重要策略之一。其中最具代表性的突破則是完全人源化新型重組融合蛋白CTLA4-Ig的研發(fā)成功,它能選擇性阻斷B7:CD28/CTLA4系統(tǒng)并在防治RA的動物實驗尤其是臨床研究中取得顯著療效。2005年12月美國FDA在國際上首次正式批準(zhǔn)CTLA4-Ig作為一線藥臨床應(yīng)用于中至重度RA的治療。從而為這一策略的更深入研究尤其是RA的臨床應(yīng)用奠定了堅實的基礎(chǔ)。然而,縱觀目前國際上探索B7:CD28/CTLA-4系統(tǒng)誘導(dǎo)免疫耐受防治RA的研究手段,采用的均是以CTLA4-Ig或抗B7單抗/多抗來進行封閉或阻斷。其缺陷在于:第一,無論是抗CTLA4-Ig或B7單抗/多抗的封閉或阻斷,均不能誘導(dǎo)長期免疫耐受;第二,僅僅封閉B7:CD28/ CTLA-4系統(tǒng)所誘導(dǎo)的T細胞免疫耐受可被感染等因素所引起釋放的IL-2及其它細胞因子所逆轉(zhuǎn),導(dǎo)致治療無效或失敗;第三,仍存在其它的共刺激信號途徑可以補償CD28信號的缺失,而旁路激活CD28+T細胞。針對上述缺陷,本課題擬將免疫耐受與基因治療性疫苗兩大策略充分進行有機結(jié)合創(chuàng)新性研制全新型pcDNA3.1/B7-2-PE40外毒素融合基因疫苗,并系統(tǒng)觀察了該新型疫苗對CIA防治的療效,探討了其相關(guān)作用機制,獲得如下研究結(jié)果: 勿庸置疑,本研究的關(guān)鍵是能否成功構(gòu)建在真核細胞中高效表達的pcDNA3.1/B7-2-PE40外毒素融合基因疫苗。為此,本課題首先以原核表達載體pRSETA/B7-2-PE40KDEL質(zhì)粒為模板,采用PCR及酶切連接的方法構(gòu)建真核表達載體pcDNA3.1/B7-2-PE40。在基因測序證實B7-2-PE40真核表達載體構(gòu)建成功的基礎(chǔ)上,采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的方法將B7-2-PE40真核表達載體轉(zhuǎn)染入CHO-K1-RPE.40細胞,經(jīng)ZeocinTM篩選獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞株后,利用RT-PCR、Western Blot及ELISA的方法分別從mRNA和蛋白水平檢測了B7-2-PE40在CHO-K1-RPE.40真核細胞中的表達情況。檢測結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染入真核細胞的pcDNA3.1/ B7-2-PE40質(zhì)粒經(jīng)歷轉(zhuǎn)錄、翻譯及翻譯后修飾被分泌至胞外,相對分子質(zhì)量約為90kDa,平均106個轉(zhuǎn)染細胞24h表達0.23μg/L。將穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞與CD28高表達細胞系人淋巴瘤細胞系Jurkat和CD28低表達的人Burkitt’s淋巴瘤細胞系Raji共孵育,采用MTT法對其特異性殺傷活性進行了測定。活性測定顯示,真核載體所表達的B7-2-PE40能特異性殺傷高表達CD28的Jurkat細胞,而對低表達CD28的Raji細胞抑制率甚低。由此證明本課題構(gòu)建的pcDNA3.1/B7-2-PE40真核表達載體可在真核細胞中高效表達,且表達產(chǎn)物具有很好的靶向免疫抑制活性。 在此基礎(chǔ)上,我們選擇了肌肉注射結(jié)合電脈沖刺激的方法,將150μg pcDNA3.1/ B7-2-PE40外毒素融合基因疫苗注入CIA大鼠體內(nèi),利用RT-PCR和流式細胞計數(shù)的方法檢測了B7-2-PE40在活體內(nèi)的表達情況及生物學(xué)活性。結(jié)果顯示pcDNA3.1/B7-2-PE40質(zhì)粒進入機體2天即可檢測出mRNA,14天達到高峰,而后逐漸減弱,至第56天基本檢測不到。其真核表達產(chǎn)物B7-2-PE40可發(fā)揮特異性細胞殺傷活性,在pcDNA3.1/B7-2-PE40質(zhì)粒肌肉注射第2d時,CIA大鼠體內(nèi)CD28+T細胞已被明顯殺傷。第4天時,CD28+T細胞下降至最低,達34%。此后有短暫恢復(fù)。隨著B7-2-PE40在14天表達高峰的到來,在第21天時再一次下降至低谷。后由于B7-2-PE40表達的降低,CD28+ T細胞所占比例逐漸增加,并于第56天時恢復(fù)至正常水平。ELISA檢測結(jié)果表明,pcDNA3.1/B7-2-PE40質(zhì)粒表達產(chǎn)物作為異源蛋白在體內(nèi)的的抗原性較低,基本上不產(chǎn)生針對PE40的抗體。上述結(jié)果表明,我們所研制的pcDNA3.1/ B7-2-PE40外毒素融合基因疫苗可在大鼠體內(nèi)表達并發(fā)揮作用。 那么,這種全新型的pcDNA3.1/ B7-2-PE40外毒素融合基因疫苗所表達的產(chǎn)物是否具有生物學(xué)功能?尤其是在RA大鼠模型體內(nèi)能否有效的防治CIA病情的發(fā)生與發(fā)展?這是我們最為關(guān)注的大問題。因此我們采用雞Ⅱ型膠原在Wistar大鼠中建立了CIA作為RA的動物模型,造模成功率為80%。經(jīng)四肢關(guān)節(jié)腫脹程度評分、放射影像學(xué)和組織病理學(xué)驗證,該模型與文獻報道的一致,完全符合CIA大鼠RA模型體內(nèi)實驗治療的標(biāo)準(zhǔn)要求。而后我們分別觀察了該新型外毒素融合基因疫苗預(yù)防和治療CIA大鼠的效應(yīng)。將不同劑量的pcDNA3.1/B7-2-PE40外毒素融合基因疫苗分別在誘導(dǎo)CIA模型的當(dāng)天預(yù)防性或第12天治療性給予CIA大鼠,綜合四肢關(guān)節(jié)腫脹程度評分、組織病理學(xué)變化和抗CⅡ抗體的滴度變化來系統(tǒng)評價對CIA疾病進程的影響。預(yù)防各組在誘導(dǎo)CIA模型的第一周中均會出現(xiàn)微弱的關(guān)節(jié)炎癥表現(xiàn)。隨著B7-2-PE40質(zhì)粒的表達,關(guān)節(jié)炎癥狀會逐漸消失。劑量為200μg/只的預(yù)防組在10周內(nèi)均能很好地抑制關(guān)節(jié)炎的發(fā)生,減輕關(guān)節(jié)炎的嚴(yán)重程度,其效果優(yōu)于“金標(biāo)準(zhǔn)”的MTX組。而在劑量為300μg/只的預(yù)防組中僅部分地抑制了關(guān)節(jié)炎癥的發(fā)生,從第3周起,關(guān)節(jié)炎癥逐漸明顯。pcDNA3.1空載體預(yù)防組無任何預(yù)防效果,其臨床積分類似于CIA對照組。治療各組是在誘導(dǎo)CIA模型的第12天出現(xiàn)足爪紅腫時,分別給予每只150μg、200μg和300μg劑量的pcDNA3.1/B7-2-PE40基因疫苗,結(jié)果發(fā)現(xiàn)在給予基因疫苗治療的第5天后即開始發(fā)揮作用,一直延續(xù)到第10周實驗結(jié)束后。200μg/只治療組、300μg/只治療組的療效與標(biāo)準(zhǔn)低劑量MTX/1次/周×4周治療組的接近,均可明顯減輕四肢關(guān)節(jié)腫脹程度,降低疾病發(fā)生率;而150μg/只治療組的關(guān)節(jié)炎癥指數(shù)略高于上述三組,但明顯低于pcDNA3.1空載體治療組及CIA對照組。與CIA對照組相比,pcDNA3.1空載體組對CIA大鼠四肢關(guān)節(jié)腫脹程度無任何治療作用,兩組的臨床評分基本接近。應(yīng)說明的是,在300μg/只治療組大鼠膠原注射處可見潰瘍形成,且經(jīng)久不愈。組織病理結(jié)果與肉眼觀察相一致;pcDNA3.1空載體對照組的結(jié)果與CIA組類似。而經(jīng)pcDNA3.1/B7-2-PE40基因疫苗預(yù)防及治療后的各組均有一定程度的改善:滑膜增生減弱,炎性細胞浸潤明顯減少,少見纖維樣物質(zhì)沉積,基本看不到骨及軟骨的破壞。在治療各組中,MTX治療組病理改變最好,其次為200μg治療組;而在預(yù)防各組中,200μg預(yù)防組病理改善表現(xiàn)優(yōu)于MTX預(yù)防組。300μg預(yù)防組的病理表現(xiàn)類似于CIA對照組,可見炎性細胞浸潤,纖維增生,局部有壞死及肉芽腫形成。通過ELISA檢測體內(nèi)抗CⅡ抗體滴度的變化表明,與CIA對照組相比,200μg預(yù)防組和MTX組可明顯降低體內(nèi)抗CⅡ抗體水平(P0.05),而其他各組盡管也能降低抗CⅡ抗體水平,但無統(tǒng)計學(xué)差異。上述結(jié)果提示200μg/只劑量的pcDNA3.1/B7-2-PE40基因疫苗可有效防治CIA疾病的發(fā)生,緩解CIA疾病的進程。 為了探索pcDNA3.1/B7-2-PE40基因疫苗有效防治CIA大鼠的相關(guān)機制,我們系統(tǒng)觀察了CIA大鼠注射pcDNA3.1/B7-2-PE40基因疫苗后對其免疫系統(tǒng)的影響。研究結(jié)果表明,該基因疫苗在體內(nèi)所表達的B7-2-PE40能有效殺傷CD28+ T細胞,提高CD4+ CD25+ Treg細胞亞群及CD8+ CD28- Ts細胞亞群的比例;有效糾正CIA產(chǎn)生的Th1偏移,下調(diào)CD4/CD8比值,明顯降低炎性細胞因子TNF-α和IFN-γ的濃度(P0.05),抑制IFN-γ分泌型Th1細胞的產(chǎn)生,促進抗炎細胞因子IL-10及IL-4分泌型Th2細胞的生成。而對IL-2和TGF-β的影響不大,尤其是對IL-4基本沒有影響。上述結(jié)果證實pcDNA3.1/B7-2-PE40基因疫苗主要是通過抑制致病性T細胞的活化,糾正T細胞亞群及細胞因子網(wǎng)絡(luò)的失衡,抑制B細胞介導(dǎo)的針對膠原的體液免疫應(yīng)答來有效控制并減緩CIA的發(fā)生與發(fā)展的。 總之,本研究在國際上原創(chuàng)性的研制成功首個新型pcDNA3.1/B7-2-PE40外毒素融合基因疫苗,它能在體內(nèi)有效表達具有特異靶向阻斷B7:CD28共刺激信號途徑的B7-2-PE40外毒素融合蛋白,經(jīng)CIA大鼠模型證實該基因疫苗能有效地預(yù)防和治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的發(fā)生與發(fā)展,并對其相關(guān)作用機制進行了探討,為今后臨床進一步研究及應(yīng)用奠定了堅實基礎(chǔ),也為類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的治療提供了更多更廣的新思路和新策略。
【圖文】：

抗性基因的真核表達載體pcDNA3.1/B7-2-PE40按圖1所示構(gòu)建（真核表達載體圖見附錄1）。用所設(shè)計的PCR引物擴增人B7-2-PE40，擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析，可見預(yù)期大小為1919bp的特異性條帶（圖2）。將雙酶切回收后產(chǎn)物克隆入真核表達載體pcDNA3.1/Zeo(+)的KpnⅠ和XbaⅠ酶切位點，，構(gòu)建成pcDNA3.1/B7-2-PE40 重組質(zhì)粒，經(jīng)質(zhì)粒提取、雙酶切后電泳（圖3）和測序鑒定結(jié)果（圖4，測序圖見附錄2），得到陽性克隆。測序顯示信號肽之后的堿基序列沒有發(fā)生點突變和移碼突變，與原核表達質(zhì)粒pRSETA－B7-2-PE40KDEL中的基因序列完全一致，與人B7-2以及PE40蛋白一、二級結(jié)構(gòu)比對結(jié)果見表1。

2.1 pcDNA3.1/B7-2-PE40 真核表達載體的構(gòu)建為使B7-2-PE40融合基因可在真核細胞中表達，一個含有B7-2-PE40以及Zeo抗性基因的真核表達載體pcDNA3.1/B7-2-PE40按圖1所示構(gòu)建（真核表達載體圖見附錄1）。用所設(shè)計的PCR引物擴增人B7-2-PE40，擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析，可見預(yù)期大小為1919bp的特異性條帶（圖2）。將雙酶切回收后產(chǎn)物克隆入真核表達載體pcDNA3.1/Zeo(+)的KpnⅠ和XbaⅠ酶切位點，構(gòu)建成pcDNA3.1/B7-2-PE40 重組質(zhì)粒，經(jīng)質(zhì)粒提取、雙酶切后電泳（圖3）和測序鑒定結(jié)果（圖4，測序圖見附錄2），得到陽性克隆。測序顯示信號肽之后的堿基序列沒有發(fā)生點突變和移碼突變，與原核表達質(zhì)粒pRSETA－B7-2-PE40KDEL中的基因序列完全一致
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2008
【分類號】：R392

【參考文獻】

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本文編號：2564256