【摘要】：G蛋白偶聯(lián)受體激酶(GRK)是GPCR信號(hào)通路的負(fù)性調(diào)節(jié)因子。近來(lái)的研究發(fā)現(xiàn),GRK除了磷酸化受體使其脫敏外,還能與其他非受體底物結(jié)合,功能呈現(xiàn)多樣性。GRK2和GRK5是GRK家族成員之一,我們以前的研究證明,GRK2能與EGFR形成復(fù)合物,但功能并不清楚;有研究表明,干擾GRK5表達(dá)后,分裂期細(xì)胞數(shù)目增多,但機(jī)制不清楚;在神經(jīng)元發(fā)育中GRK5有階段性高表達(dá),但作用不清楚。本實(shí)驗(yàn)室干擾GRK5表達(dá)后基因芯片檢測(cè)結(jié)果也顯示,細(xì)胞周期以及神經(jīng)元發(fā)育相關(guān)的基因有顯著上調(diào)。 在此基礎(chǔ)上,本研究對(duì)GRK2在信號(hào)通路交叉對(duì)話中的功能做了探討,并深入探索了GRK5在細(xì)胞周期以及神經(jīng)元發(fā)育中的生理功能,并對(duì)其機(jī)制做了探討。 GRK2在信號(hào)通路交叉對(duì)話中的作用研究顯示:1)EGF信號(hào)刺激下,GRK2向細(xì)胞膜轉(zhuǎn)位;2)EGF預(yù)處理后導(dǎo)致GRK2介導(dǎo)的阿片受體內(nèi)吞增加。 GRK5對(duì)細(xì)胞周期的調(diào)控研究顯示:1)在Hela細(xì)胞中干擾GRK5的表達(dá)以后,組蛋白3磷酸化陽(yáng)性以及Tunel染色陽(yáng)性的細(xì)胞增多,表明GRK5的下調(diào)引起分裂中期細(xì)胞增多以及細(xì)胞凋亡增加;2)采用DAPI標(biāo)記染色體,β-tubulin抗體標(biāo)記紡錘體,發(fā)現(xiàn)GRK5表達(dá)的下調(diào)導(dǎo)致染色體不能正常排列到赤道板,對(duì)分裂后期胞質(zhì)的分裂沒(méi)有影響;3)活細(xì)胞觀察結(jié)果也表明,GRK5表達(dá)的下調(diào)使細(xì)胞不能正常通過(guò)有絲分裂期而進(jìn)入凋亡途徑。 GRK5調(diào)節(jié)神經(jīng)元形態(tài)發(fā)育研究表明:1)在體外培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元中,過(guò)表達(dá)GRK5可以誘導(dǎo)神經(jīng)突起的生長(zhǎng),促進(jìn)神經(jīng)元的發(fā)育。當(dāng)過(guò)表達(dá)GRK5激酶活性缺失突變體K215R也能促進(jìn)神經(jīng)突起的生長(zhǎng),這些結(jié)果表明,GRK5能夠促進(jìn)神經(jīng)元突起的生長(zhǎng),并且這一功能不依賴于它的激酶活性。2)GRK5與actin在神經(jīng)元生長(zhǎng)錐中共定位,在體外GRK5與F-actin能互相結(jié)合,促進(jìn)F-actin聚合成束,actin結(jié)合位點(diǎn)突變后,GRK5不能促進(jìn)神經(jīng)突起的生長(zhǎng),這些結(jié)果表明,GRK5通過(guò)促進(jìn)actin的成束作用來(lái)調(diào)節(jié)神經(jīng)突起的生長(zhǎng)。3)在體外培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元中共轉(zhuǎn)GRK5以及各RhoGTPase的活性突變體后發(fā)現(xiàn),Rac1以及cdc42活性缺失及RhoA的持續(xù)激活體能夠抑制GRK5這一功能,表明GRK5促進(jìn)神經(jīng)突起長(zhǎng)出的這一作用有Rho GTPases的參與。4)在子宮內(nèi)胚胎電轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn)中,用RNAi干擾GRK5的表達(dá)以后,發(fā)現(xiàn)遷移到皮質(zhì)的神經(jīng)元樹(shù)突的分支和長(zhǎng)度較對(duì)照組減少。GRK5表達(dá)下調(diào)以后對(duì)神經(jīng)前體細(xì)胞的極化和遷移過(guò)程沒(méi)有影響。5)在GRK5基因敲除小鼠中,海馬神經(jīng)元樹(shù)突棘變細(xì)長(zhǎng),頭頸比變小,形態(tài)異常。 綜上所述,本研究首次證明:1)GRK2介導(dǎo)了EGF受體信號(hào)通路對(duì)阿片受體內(nèi)吞的調(diào)節(jié)。2)GRK5對(duì)細(xì)胞分裂中期染色體到赤道板的正確排列是必需的,GRK5通過(guò)維持染色體在赤道板的正確排列參與對(duì)細(xì)胞周期的調(diào)控。3)研究首次發(fā)現(xiàn)GRK5在神經(jīng)元形態(tài)發(fā)育和維持中具有重要作用。GRK5能夠促進(jìn)神經(jīng)元突起的生長(zhǎng),并且這一作用不依賴其激酶活性;GRK5通過(guò)促進(jìn)actin成束作用調(diào)節(jié)神經(jīng)突起的生長(zhǎng)。本研究闡述了GRK2在信號(hào)交叉對(duì)話中的作用、GRK5在細(xì)胞周期中的作用以及GRK5在神經(jīng)元發(fā)育中的作用及機(jī)制,揭示了GRK的新的功能。
【學(xué)位授予單位】：復(fù)旦大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2009
【分類號(hào)】：R341

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本文編號(hào)：2561680