【摘要】： Luman募集因子(Luman-recruiting factor,LRF)是堿性亮氨酸拉鏈蛋白轉(zhuǎn)錄因子,是Luman活化過程中必需的輔助因子,募集Luman進(jìn)入特定的亞核區(qū),促進(jìn)有活性的轉(zhuǎn)錄復(fù)合物的形成。目前,對(duì)于LRF的生理功能尚不清楚,獲得其單克隆抗體對(duì)于研究LRF的生理功能有非常重要的意義。 本研究測(cè)定分析了GST-LRF融合蛋白在E.coli BL21(DE3)中高效表達(dá)的條件,以純化的目的蛋白作為抗原,免疫BALB/C小鼠,制備單克隆抗體并進(jìn)行鑒定。獲得以下結(jié)果: 1 GST-LRF融合蛋白(glutathione S-transferase,GST)在E.coli BL21(DE3)中高效表達(dá)的條件為:37℃、0.1 mmol/L IPTG、誘導(dǎo)表達(dá)5 h。電洗脫法純化得到了高純度的目的蛋白。 2確定了檢測(cè)抗GST-LRF融合蛋白抗體的間接ELISA的最佳作用條件:辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG (酶標(biāo)二抗)的工作濃度為1:1 200;包被抗原為10μg/mL;包被液為pH 9.6,0.05 M碳酸鹽緩沖液;包被條件選擇37℃作用2 h或4℃過夜;封閉液為1.0%明膠,封閉條件為37℃作用1 h。 3用間接ELISA篩選陽性孔,通過有限稀釋法篩選出3株分泌抗GST-LRF單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株:A2E4、B2G6、D2F5。 4采用腹水誘生法制備了A2E4、B2G6、D2F5 3株雜交瘤細(xì)胞的單克隆抗體,間接ELISA測(cè)定腹水抗體效價(jià)均為1:10 000,交叉性試驗(yàn)表明制備的單抗具有特異性,ELISA測(cè)定抗體的相對(duì)親和力分別為:0.773μg/mL、0.800μg/mL和0.355μg/mL。
【圖文】：

2.2.2 誘導(dǎo)劑濃度對(duì)蛋白表達(dá)的影響在不同濃度誘導(dǎo)劑 IPTG 0.1 mmol/L、0.5 mmol/L、1 mmol/L、2 mmol/L、3 mmol/L，，其他條件不變的條件下進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，SDS-PAGE 分析（見圖 2-2）；

重組蛋白可溶性分析融合蛋白可溶性分析結(jié)果表明，重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化菌經(jīng)裂解處理后，裂解液上清沒有蛋白條帶，而在沉淀中則出現(xiàn)了明顯的蛋白條帶（圖 2-4），提示表達(dá)的目的蛋要以包涵體的形式存在于表達(dá)產(chǎn)物。
【學(xué)位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2008
【分類號(hào)】：R392.6

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本文編號(hào)：2559003