【摘要】：分枝桿菌尤其是結(jié)核分枝桿菌是引起人類患結(jié)核病的主要病原微生物,目前結(jié)核病仍然是我國嚴重的公共衛(wèi)生問題。本文旨在通過對結(jié)核分枝桿菌(北京譜系)的群體遺傳關(guān)系及膿腫分枝桿菌中硝基還原酶基因的克隆表達相關(guān)研究,希望能夠為結(jié)核病防控策略的制定及快速準確的鑒定分枝桿菌提供參考依據(jù)。 本文首先采用24位點VNTR基因分型技術(shù)對我國北方五省(黑龍江、吉林、遼寧、內(nèi)蒙古和寧夏)的234株結(jié)核分枝桿菌(北京譜系)進行了分型鑒定,各VNTR位點的等位基因多態(tài)性(h)普遍較低(h值范圍：0.000-0.744)；個體水平系統(tǒng)發(fā)育分析顯示各菌株分散存在于N-J樹的各個進化分枝,最小生成樹中約62.0%(145/234)的菌株被劃分到同一“克隆復合群”;群體水平系統(tǒng)發(fā)育樹顯示234株菌與MIRU-VNTRplus數(shù)據(jù)庫(http://www.miru-vntrplus.org)中的結(jié)核分枝桿菌(北京譜系)的遺傳關(guān)系最近(Bootstrap值為100)；通過貝葉斯模型計算了最近共祖年代約為5308年(95%CIs：4263年-6470年)；分子方差分析結(jié)果表明吉林與黑龍江、遼寧兩省菌株之間,內(nèi)蒙古與寧夏菌株之間遺傳分化系數(shù)不存在顯著統(tǒng)計學差異(P0.05)。 采用生物信息學方法對膿腫分枝桿菌中被注釋為" putative nitroreductase "的基因進行了預測分析,結(jié)果顯示該基因編碼219個氨基酸；對應的蛋白質(zhì)是一種不穩(wěn)定的親水性蛋白質(zhì)(不穩(wěn)定系數(shù)為54.52,總平均親水性為-0.244)；理論分子量和等電點分別為24.38KDa和6.52；蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)以α-螺旋、β-折疊和無規(guī)卷曲為主要構(gòu)件；氨基酸序列與蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫中3gr3蛋白A鏈的相似性最高為60%,空間結(jié)構(gòu)預測表明該蛋白是硝基還原酶家族成員之一,可能具有還原對硝基苯甲酸的功能。 利用大腸桿菌表達系統(tǒng)對"putative nitroreductase"基因進行了體外表達,目的蛋白以包涵體形式存在；采用親和層析方法對包涵體蛋白進行了純化,并通過透析復性處理,得到了可溶性的目的蛋白；灰度掃描分析結(jié)果顯示其純度為89.6%; Western blot結(jié)果顯示在約30KDa處得到了顯色帶,且特異性較好；BCA蛋白定量法測得其濃度為0.59μg/μL;酶的比活力為32.2U/mg。 應用Plackett-Burman設計考察了影響目的蛋白表達量的胰蛋白胨、酵母提取物、NaCl、IPTG、誘導溫度、誘導時間、卡那霉素濃度和pH值8個因素,從中篩選出了IPTG濃度、誘導溫度和誘導時間三個主要影響因素；通過最陡爬坡實驗逼近最大響應區(qū)域并找出了響應面優(yōu)化的中心點；運用Box-Behnken設計及響應面分析法確定了重要因素的最佳水平,即IPTG濃度：0.67mM、誘導溫度：40℃、誘導時間：6.8h,Y的最大估計值為59.4%。對模型預測的準確性進行了驗證,實驗結(jié)果接近優(yōu)化預測值。
【學位授予單位】：河南工業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R378.911

【參考文獻】

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本文編號：2546688