【摘要】：研究背景：結核病是一個全球性的嚴重公共衛(wèi)生問題,我國是全球22個結核病高負擔國家之一，同時也是全球27個耐多藥結核病(MDR-TB)及廣泛耐藥結核病(XDR-TB)流行嚴重的國家之一。因此，結核病的防治形勢依然相當嚴峻。已有研究證實γδ T細胞對結核桿菌抗原的刺激有較強的應答活性，提示γδ T細胞可能與宿主抗結核感染的保護性免疫作用相關。但γδ T細胞參與非特異性或/和特異性抗結核免疫反應的機制并沒有完全清楚。產(chǎn)生IL-17的γδ T細胞也可能涉及TB的發(fā)病過程。γδ T細胞是受到何種條件和調(diào)控機制產(chǎn)生這種炎癥性細胞因子IL-17的，這對于了解結核病的發(fā)病機制有一定的學術理論意義。通常測定產(chǎn)生IFN-γ的細胞應用的是流式細胞術檢測胞內(nèi)細胞因子產(chǎn)生，其刺激劑為非抗原特異性的PMA+Ionomycin，而具有抗原特異性的Mtb-HAg刺激γδ T細胞產(chǎn)生IFN-γ的測定報道很少。酶聯(lián)免疫斑點試驗（T.SPOT-TB）通過檢測IFN-γ濃度反映釋放IFN-γ的T淋巴細胞數(shù)目，準確判斷是否存在結核菌感染，敏感性和特異性較高，但對于檢測γδ T細胞產(chǎn)生細胞因子的報道很少。TNF-α是參與結核病的免疫應答及免疫發(fā)病過程的一種重要因子，目前已知的研究中關于其在結核感染狀態(tài)下外周血中的含量研究較少。 目的：檢測健康人，TB患者外周血分離成單個核細胞（PBMC）后用非特異性刺激劑（PMA+Iono、PHA）和特異性刺激劑（Mtb-HAg）刺激后，用流式細胞術或ELISPOT方法檢測T細胞亞群產(chǎn)生IFN-γ和IL-17以及TNF-α的變化，以描述健康人和TB患者之間γδ T細胞天然性免疫和特異性免疫的差異，為TB患者不同病程階段免疫功能狀態(tài)的判定提供新的指標。 方法：1.流式細胞術檢測不同刺激劑刺激γδ T細胞后產(chǎn)生IFN-γ和IL-17的細胞 采集健康人外周血，分別用PMA+Iono、Mtb-HAg、Mtb-HAg+IL-23、PHA、PHA+IL-23刺激培養(yǎng)，PMA+Iono刺激培養(yǎng)6小時，其余組刺激培養(yǎng)16小時，每組均加入莫能霉素（Monensin）阻斷4小時，收集細胞，加入熒光標記單抗進行表面分子和胞內(nèi)染色，流式細胞儀檢測產(chǎn)生IFN-γ和IL-17的γδ T細胞比例，同時檢測αβ T細胞比例作為對照。 2. ELISOPT檢測γδ T細胞不同刺激劑刺激后產(chǎn)生IFN-γ細胞 2.1健康人的外周血分離PBMC后，按10萬個細胞/孔種入已包被IFN-γ抗體的孔中，對照組加入PHA、結核桿菌抗原A+結核桿菌抗原B，剩余細胞用免疫磁珠分選出γδ+T后，，通過熒光染色確定細胞數(shù)后，按1.5萬/孔，3萬/孔，6萬/孔種入板中，37℃培養(yǎng)20h后洗滌孵育顯色，最后檢測斑點數(shù)計算產(chǎn)生IFN-γ的細胞數(shù)。 2.2健康人的外周血分離PBMC后，按10萬個細胞/孔種入已包被IFN-γ的孔中，對照組加入PHA、結核桿菌抗原A+結核桿菌抗原B，剩余細胞用免疫磁珠分選出γδ+T后，通過熒光染色確定細胞數(shù)后，按3萬-5萬細胞/孔種入板中，37℃培養(yǎng)20h后洗滌孵育顯色，最后檢測斑點數(shù)計算產(chǎn)生IFN-γ的細胞數(shù)。 3.流式細胞術檢測不同刺激劑刺激γδ T細胞后產(chǎn)生IFN-γ和TNF-α的細胞 采集健康人和TB患者外周血（或凍存的PBMC），分別用PMA+Iono、Mtb-HAg、PHA刺激培養(yǎng)，PMA+Iono刺激培養(yǎng)6小時，其余組刺激培養(yǎng)16小時，每組均加入莫能霉素（Monensin）阻斷4小時，收集細胞，加入熒光標記單抗進行表面分子和胞內(nèi)染色，流式細胞儀檢測產(chǎn)生IFN-γ和TNF-α的γδ T細胞比例，同時檢測αβ T細胞比例作為對照。 結果：1.1健康人外周血T細胞經(jīng)不同刺激劑刺激后，αβ T和γδ T兩個亞群均能產(chǎn)生IFN-γ，產(chǎn)生IFN-γ的γδ T細胞比例比產(chǎn)生IFN-γ的αβ T細胞比例要高。其中Mtb-HAg組健康人外周γδ T產(chǎn)生的IFN-γ比例明顯高于αβ T細胞，差異有顯著性（p0.01）。 1.2健康人外周血T細胞經(jīng)不同刺激劑刺激后，αβ T和γδ T兩個亞群均能產(chǎn)生IL-17。 PMA組、Mtb-HAg組、Mtb-HAg+IL-23組及PHA組，健康人外周γδ T產(chǎn)生的IL-17比例明顯高于αβ T細胞，差異均有顯著性(p＜0.05）。 2.用ELISPOT方法檢測Mtb-HAg刺激外周血γδ T細胞產(chǎn)生IFN-γ斑點的每孔最適細胞數(shù)約為30000—50000個γδ+T細胞。 3.1健康人及結核病人外周血T細胞經(jīng)不同刺激劑刺激后，αβ T和γδ T兩個亞群均能產(chǎn)生IFN-γ，產(chǎn)生IFN-γ的γδ T細胞比例比產(chǎn)生IFN-γ的αβ T細胞比例要高。PMA組健康人外周αβ T產(chǎn)生的IFN-γ比例明顯高于結核病人組，差異有顯著性（p0.05）；PMA組、Mtb組和PHA組健康人外周γδ T產(chǎn)生的IFN-γ比例高于結核病人組，差異有顯著性，分別為p0.05，p0.01和p0.05 3.2健康人及結核病人外周血T細胞經(jīng)不同刺激劑刺激后，αβ T和γδ T兩個亞群均能產(chǎn)生TNF-α。 PMA組和PHA組健康人外周αβ T產(chǎn)生的TNF-α比例高于結核病人組，差異有顯著性（p0.05）；PMA組和PHA組健康人外周γδ T產(chǎn)生的TNF-α比例高于結核病人組，差異有顯著性，分別為p0.05和p0.05。 結論：1. Mtb-HAg刺激健康人外周γδT細胞后產(chǎn)生IFN-γ的細胞顯著高于αβ T細胞。 2.健康人γδ T細胞中產(chǎn)生IFN-γ的細胞數(shù)均比TB患者的高。 3.健康人γδ T細胞中產(chǎn)生IL-17的細胞數(shù)比αβ T細胞中的高。 4.不管是健康人還是結核病人，產(chǎn)生TNF-α的γδ T細胞的比例均高于產(chǎn)生TNF-α的αβ T細胞的比例。 5.通過非特異性刺激劑刺激健康人γδ T細胞中分泌TNF-α細胞的比例高于結核病人γδ T細胞中的比例。
【學位授予單位】：蚌埠醫(yī)學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R378.911

【參考文獻】

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本文編號：2527478