【摘要】： 脂肪干細胞不僅具有跟骨髓間充質(zhì)干細胞相似的多向分化潛能,而且具有取材方法簡便、來源廣泛、患者創(chuàng)傷小等優(yōu)勢,這都使其成為近年來干細胞研究領域中的熱點。干細胞應用的一個重要方向就是脂肪組織工程,由于脂肪干細胞具有上述優(yōu)點,這無疑令脂肪干細胞成為構建工程脂肪組織的種子細胞的最佳選擇,如何實現(xiàn)脂肪干細胞的成脂分化,是構建工程脂肪組織重要的研究課題。 本實驗目的在于對通過共培養(yǎng)人體吸脂來源的脂肪干細胞與脂肪細胞,促使脂肪干細胞進行成脂分化,并通過各種生物學檢測手段,觀察干細胞經(jīng)過共培養(yǎng)后的成脂分化效果。 具體方法是:首先采用膠原酶消化的方法,從吸脂手術來源的人體脂肪組織中,分別分離得到人體脂肪干細胞和脂肪細胞。對分離得到的脂肪細胞在顯微鏡下進行細胞形態(tài)觀察、特異性的油紅O染色并拍照觀察、臺盼藍死活染色并拍照觀察、脂肪細胞的培養(yǎng)觀察等鑒定檢測的實驗;對于分離得到的脂肪干細胞在顯微鏡下進行細胞形態(tài)觀察、cck-8法檢測動力學生長曲線、對脂肪干細胞成脂誘導后進行特異性的油紅O和臺盼藍復合染色實驗、Hoechst熒光染色、流式細胞儀進行細胞表面抗原的檢測。 通過以上的實驗觀察和檢測,證明本實驗收獲的細胞確實為形態(tài)完整,功能健全的脂肪干細胞和脂肪細胞。 接下來把分離得到的人體吸脂來源的脂肪干細胞和脂肪細胞分別采用1:5,1:1,2:1和5:1四個比例,在Transwell中進行共培養(yǎng)。采用脂質(zhì)染料油紅O和細胞核染料臺盼藍對共培養(yǎng)后的脂肪干細胞進行染色,顯微鏡下拍照觀察細胞形態(tài),并計算成脂分化率。同時,通過混合成脂誘導方法誘導脂肪干細胞,并以此為成脂分化的陽性對照組,以不加任何誘導劑的普通培養(yǎng)基培養(yǎng)的脂肪干細胞為成脂分化的陰性對照組。結(jié)合共培養(yǎng)對照組,分析考察了本實驗共培養(yǎng)條件下,各個不同細胞比例培養(yǎng)組之間,成脂誘導分化效果的差異。 實驗結(jié)果證明:用脂肪干細胞與脂肪細胞的共培養(yǎng)這種方式,共培養(yǎng)8天內(nèi)尚不能促使脂肪干細胞成脂分化。對于未能實現(xiàn)干細胞成脂分化的原因可能有如下兩點:一是共培養(yǎng)時間過短所致。第二點原因則可能是單純這種干細胞與脂肪細胞共培養(yǎng)方法并不能實現(xiàn)干細胞向成脂方向的分化。 鑒于以上第一點原因,本人將共培養(yǎng)時間延長至20天,并采用流式細胞儀分析共培養(yǎng)后脂肪干細胞表面抗原標記的表達。同時,對共培養(yǎng)后的脂肪干細胞進行了Hoechst和PI的死活熒光檢測。 實驗結(jié)果表明:經(jīng)過20天共培養(yǎng)的脂肪干細胞仍未發(fā)生明顯的成脂分化現(xiàn)象,但其表面抗原CD105的表達發(fā)生明顯降低,這可能意味著脂肪干細胞經(jīng)過共培養(yǎng)后發(fā)生了一定程度的分化。 本實驗在脂肪干細胞成脂分化研究領域內(nèi),首次嘗試了以利用脂肪干細胞與脂肪細胞二者間接共培養(yǎng)的方式進行脂肪干細胞的成脂誘導分化,并通過各種生物學檢測手段對成脂分化共培養(yǎng)后的脂肪干細胞進行了分化效果的檢驗,對進一步研究脂肪干細胞的成脂誘導方法和機理具有指導意義。
【圖文】：

圖1.1組織再生_l:程系統(tǒng)示意圖 F191.1TissueRegenerationSystemdiagram圖1.1展示了再生組織工程具體實現(xiàn)的系統(tǒng)過程(圖片來源于網(wǎng)絡，網(wǎng)址為ims.Postech.ac.kr)。首先，模仿人體自然組織的結(jié)構，根據(jù)患者自身需要，利用計算機輔助設計出適合的組織工程支架，然后將種子細胞接種到支架材料上形成人工工程組織構建物，，當構建物體外培養(yǎng)至適宜的大小，滿足植入條件后，便可將構建物植入體內(nèi)，

引用中不可回避的難題[79一8’]。3脂肪細胞脂肪組織主要由大量群集的脂肪細胞構成，由疏松結(jié)締組織分隔成小葉(如圖1.2所示，圖片來源于生物谷網(wǎng)站，網(wǎng)址為~.bioon.Com)。脂肪組織通常分為兩類:第一類是黃(白)色脂肪組織(在某些哺乳動物呈白色)，即通常所說的脂肪組織。它由大量單泡脂肪細胞集聚而成，細胞中央有一大脂滴，胞質(zhì)呈薄層，位于細胞周緣，包繞脂滴。黃色脂肪組織主要分布在皮下、網(wǎng)膜和系膜等處，約占成人體重的10%，是體內(nèi)最大的貯能庫。參與能量代謝，并具有產(chǎn)生熱量、維持體溫、緩沖保護和支持填充等作用。第二類是棕色脂肪組織呈棕色，其特點是組織中有豐富的毛細血管，脂肪細胞內(nèi)散在許多小脂滴
【學位授予單位】：大連理工大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2009
【分類號】：R329

【引證文獻】

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1 羅云;孫桂波;秦蒙;姚帆;孫曉波;;細胞共培養(yǎng)技術在醫(yī)藥研究中的應用[J];中國中藥雜志;2012年22期

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1 武爽;魯西黃牛臍帶間充質(zhì)干細胞的分離培養(yǎng)及生物學特性研究[D];中國農(nóng)業(yè)科學院;2012年

本文編號：2522314