【摘要】：隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)發(fā)展,人類生活方式的改變,男性不育的發(fā)病率逐年升高。由于男性不育的發(fā)病機(jī)制和某些環(huán)節(jié)還不甚了解,男性不育的治療面臨著治療手段單一,治療效果欠佳的局面。目前,睪丸生精功能下降所致無精子癥尚無確切療效的治療方法。 精原干細(xì)胞(spermatogonial stem cells,SSCs)是精子形成的前體細(xì)胞,具有永生化和多能化潛能,在睪丸微循環(huán)中具有增殖分化能力�，F(xiàn)有資料證實(shí)SSCs移植于具有免疫豁免的異體睪丸內(nèi)仍可繼續(xù)分化。SSCs移植技術(shù)可以使睪丸性無精子癥患者產(chǎn)生精子并獲得生育能力,通過夫婦間常見的方式自然受孕,符合倫理學(xué)及傳統(tǒng)觀念,更易于患者接受。 SSCs移植在治療男性不育過程中可適用于青春期前和青春期進(jìn)行放化療的腫瘤患者。青春期或青春期前的男孩及青壯年男性的常見惡性腫瘤,例如:何杰金病、睪丸癌、白血病等,隨著現(xiàn)代診斷技術(shù)和外科手術(shù)、放療及化療等診療水平的日益提高,這些患者的長期生存甚至治愈成為可能。而這類患者在治療的過程中其睪丸生精功能受到嚴(yán)重?fù)p害�？紤]到這一點(diǎn),可在治療前收集患者的SSCs并通過冷凍等方法保存起來,保存其生育能力。SSCs移植也適用于成年后才發(fā)現(xiàn)的雙側(cè)隱睪,其睪丸未下降到陰囊內(nèi)的患者。這類患者睪丸在高溫的持續(xù)作用下生精功能嚴(yán)重受損,臨床表現(xiàn)為嚴(yán)重的少弱精子癥,甚至無精子癥。有研究表明,這類患者的睪丸中仍有對熱不敏感的SSCs和支持細(xì)胞,可利用SSCs培養(yǎng)及移植技術(shù)恢復(fù)睪丸生精功能。SSCs移植同時(shí)適用于嚴(yán)重的睪丸生精功能障礙患者等。近來,研究發(fā)現(xiàn)應(yīng)用自體干細(xì)胞(脂肪源性干細(xì)胞、皮膚源性干細(xì)胞等)可分化誘導(dǎo)為生殖干細(xì)胞后進(jìn)行移植,通過夫婦間正常的方式受孕。 1目的 本研究目的:1.探討分離純化精原干細(xì)胞(SSCs)的方法。2.探索簡便實(shí)用的SSCs細(xì)胞培養(yǎng)方法,降低SSCs的培養(yǎng)成本。 該研究作為自體成體干細(xì)胞(脂肪干細(xì)胞、皮膚干細(xì)胞等)移植入睪丸治療少、無精子癥系統(tǒng)研究的前期探索,將為后續(xù)研究提供寶貴經(jīng)驗(yàn),最終達(dá)到治愈睪丸性不育的目的。 2材料與方法 2.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選取出生后10天的健康SD雄性大鼠,體重19～25g,隨機(jī)分三組: 第一組:①機(jī)械法+兩步酶法制備SSCs懸液; 第二組:②機(jī)械法+兩步酶法+percoll分離法制備SSCs懸液; 第三組:③機(jī)械法+兩步酶法+percoll分離法+差速貼壁法制備SSCs懸液。 2.2實(shí)驗(yàn)方法 2.2.1取出生后10天的SD大鼠,脫頸處死后無菌收集雙側(cè)睪丸,分別通過①機(jī)械法+兩步酶法制備SSCs懸液;②機(jī)械法+兩步酶法+percoll分離法制備SSCs懸液;③機(jī)械法+兩步酶法+percoll分離法+差速貼壁法制備SSCs懸液。 2.2.2 c-kit的表達(dá)檢測 將獲得的單細(xì)胞懸液處理后加入兔抗鼠c-kit多克隆抗體,再加入山羊抗兔IgG-FITC熒光二抗,以PBS代替一抗作為對照,熒光顯微鏡下觀察c-kit的表達(dá)情況。 2.2.3α_6-Integrin的表達(dá)檢測 將純化后的細(xì)胞懸液處理后加入兔抗鼠α_6-Integrin多克隆抗體,再滴加即用型生物素化山羊抗兔IgG二抗,漂洗后滴加SABC試劑,再次漂洗。滴加DAB顯色液,以三蒸水終止染色反應(yīng),再分別經(jīng)乙醇脫水,二甲苯透明,中性樹膠封片,顯微鏡下觀察α_6-Integrin的表達(dá)情況,用以PBS代替一抗作為對照。 2.2.4臺(tái)盼藍(lán)排斥試驗(yàn)檢測 將獲得的單細(xì)胞懸液,用血球記數(shù)板分別計(jì)數(shù)活細(xì)胞和死細(xì)胞,計(jì)算細(xì)胞活性率。 2.2.5精原細(xì)胞純度的流式細(xì)胞儀檢測 將獲得的單細(xì)胞懸液固定,漂洗,再離心收集細(xì)胞。加入兔抗鼠c-Kit多克隆抗體,4℃過夜。PBS漂洗后加入山羊抗兔IgG-FITC熒光二抗,4℃避光孵育。PBS漂洗兩次,再以PBS重懸細(xì)胞后進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測。同時(shí)設(shè)立以PBS代替一抗的陰性對照,在進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測時(shí)將相應(yīng)的陰性對照消減為零,消除自發(fā)熒光背景。 2.2.6將獲得的單細(xì)胞懸液進(jìn)行培養(yǎng)觀察,免疫組化鑒定,臺(tái)盼藍(lán)排斥試驗(yàn)及流式細(xì)胞儀檢測后對結(jié)果進(jìn)行比較分析。 3結(jié)果 3.1①機(jī)械法+兩步酶法制備SSCs懸液;②機(jī)械法+兩步酶法+percoll分離法制備SSCs懸液;③機(jī)械法+兩步酶法+percoll分離法+差速貼壁法制備SSCs懸液生長情況符合SSCs。 3.2以c-kit受體作為SSCs的特異性標(biāo)記物,行細(xì)胞免疫組化染色,結(jié)果細(xì)胞膜和核周胞質(zhì)強(qiáng)表達(dá)c-kit。以α_6-Integrin受體作為SSCs的特異性標(biāo)記物,行細(xì)胞免疫組化染色,結(jié)果細(xì)胞膜和胞質(zhì)表達(dá)α_6-Integrin。兩者與之對應(yīng)的對照均呈陰性。 3.3以臺(tái)盼藍(lán)排斥試驗(yàn)檢測細(xì)胞活率:①機(jī)械法+兩步酶法細(xì)胞活率(93.26±1.06)%,②機(jī)械法+兩步酶法+percoll分離法3帶細(xì)胞活率(93.50±0.85)%,③機(jī)械法+兩步酶法+percoll分離法+差速貼壁法3帶細(xì)胞活率(94.73±0.82)%;三種方法活率比較:三種方法所得SSCs活率無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。 3.4①機(jī)械法+兩步酶法制備SSCs懸液精原細(xì)胞陽性細(xì)胞百分率為(63.34±0.79)%。②機(jī)械法+兩步酶法+percoll分離法制備SSCs懸液精原細(xì)胞陽性細(xì)胞百分率為(74.98±0.26)%。③機(jī)械法+兩步酶法+percoll分離法+差速貼壁法分離純化SSCs精原細(xì)胞陽性細(xì)胞百分率為(79.17±0.83)%。三種方法純度比較:三種方法間純度不同(P＜0.05)。多重兩兩比較結(jié)果:三種方法兩兩之間純度不同(P＜0.05):②法精原細(xì)胞陽性細(xì)胞百分率高于①法;③法精原細(xì)胞陽性細(xì)胞百分率高于②法;①,②,③法所得SSCs純度呈增高趨勢(P＜0.05)。 4結(jié)論 4.1機(jī)械法,兩步酶法,差速貼壁法,percoll分離法在分離純化過程中對SSCs活率影響一致。 4.2機(jī)械法+兩步酶法能夠分離出較高純度的SSCs,結(jié)合percoll分離法能夠使SSCs純度提高。 4.3差速貼壁法在應(yīng)用機(jī)械法,兩步酶法,percoll分離法的同時(shí)能夠進(jìn)一步富集SSCs。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2009
【分類號(hào)】：R329;R698.2

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 何方剛;劉良;黃代新;楊慶恩;李小廷;尹慧;翟仙敦;;不同條件下Percoll密度梯度離心分離組織細(xì)胞浮游生物的比較[J];中國法醫(yī)學(xué)雜志;2007年03期

2 王寧,薛京倫;精原干細(xì)胞技術(shù)的研究進(jìn)展[J];國外醫(yī)學(xué).遺傳學(xué)分冊;2003年01期

3 徐富翠;吳紹華;郭勇;梅欣明;;精原干細(xì)胞體外非分化擴(kuò)增的初步研究[J];四川大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版);2006年04期

4 李彥鋒,郭應(yīng)祿,李曉紅,靳風(fēng)爍,江軍,畢罡;人精原干細(xì)胞的磁式分選和功能鑒定[J];中華男科學(xué)雜志;2004年08期

5 李彥鋒,郭應(yīng)祿,李曉紅,靳鳳爍,孫中義,張克勤;人精原干細(xì)胞特異性標(biāo)志的初步篩選[J];中華男科學(xué)雜志;2005年07期

6 李彥鋒,郭應(yīng)祿,李曉紅;精原干細(xì)胞移植研究近展[J];中國男科學(xué)雜志;2004年03期

7 徐富翠;吳澤才;韓藝;吳紹華;;以骨髓基質(zhì)細(xì)胞為飼養(yǎng)層培養(yǎng)小鼠精原干細(xì)胞[J];中國組織工程研究與臨床康復(fù);2007年15期

8 王琳,顧丹天,甘子明;大鼠精原細(xì)胞的分離純化[J];新疆醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào);2005年01期

9 李蓮軍,李德雪,張學(xué)明,文興豪,安鐵洙,高豐,王鐵東;小鼠精原干細(xì)胞凍存后體外培養(yǎng)[J];中國應(yīng)用生理學(xué)雜志;2004年02期

10 鄭連文;王曄玲;張慕淳;鄭洪君;;Percoll離心聯(lián)合多步差異黏附法分離、純化人睪丸精原細(xì)胞[J];中國老年學(xué)雜志;2007年02期

，

本文編號(hào)：2497472