【摘要】： 本論文的研究目的,是探討白介素1受體拮抗劑(interleukin 1 receptor antagonist, IL-1Ra)在小鼠骨髓造血系統(tǒng)中的作用及機制,并且對其進行了預防化療導致的骨髓抑制的臨床前研究。實驗中采用的化療小鼠模型是通過尾靜脈一次性注射5-氟尿嘧啶(5-Fu),導致骨髓損傷和隨后的再生修復。5-Fu注射后小鼠的骨髓變化分為兩個階段:首先是第1～7天的骨髓損傷階段;接下來是第8～14天的骨髓再生修復階段。為了研究細胞因子對這一損傷 修復過程的調控,我們抽提了5-Fu注射后0、3、7、11、14天5個時間點的小鼠骨髓細胞RNA,制備了基因芯片。通過基因芯片技術檢測發(fā)現,在化療后骨髓損傷和修復過程中許多調節(jié)因子在基因水平會呈現不同趨勢的波動。其中IL-1Ra的表達呈現了先上升后下降的趨勢。 為了驗證基因芯片的結果,我們對5-Fu注射后5個時間點的小鼠血清中的IL-1Ra水平進行了ELISA檢測,得到了與芯片相一致的表達趨勢。這種表達量劇烈的波動使我們認為IL-1Ra可能作為一個內源性的造血調控因子參與了骨髓損傷的修復過程。 為了進行體內的功能研究,我們首先利用原核表達pET系統(tǒng)誘導表達了重組小鼠的IL-1Ra蛋白,并且利用陰離子交換層析的方法進行純化,得到了純度為96%以上的純化產物,經內毒素檢測合格;并通過細胞學實驗證明該蛋白具有良好的生物學活性,可以用于下一步的體內功能實驗。 本論文中通過IL-1Ra在正常小鼠的在體表達和重組蛋白注射兩個方法研究了IL-1Ra對小鼠骨髓造血系統(tǒng)的作用。對于在體表達IL-1Ra的實驗,我們構建了真核表達的重組質粒pcDNA-IL-1Ra,使用電穿孔的方式,將質粒轉染到小鼠的脛前肌。用ELISA的方法檢測轉染后不同時間點IL-1Ra在小鼠體內的表達水平。證明在轉染后的第5天小鼠血清中的IL-1Ra水平最高,隨后逐漸下降。較高水平的表達可以維持10天左右。轉染后進行pcDNA-IL-1Ra質粒組和pcDNA3.1質粒對照組小鼠的外周血和骨髓細胞數的比較。發(fā)現在第5天IL-1Ra可以降低骨髓細胞總數,并且在第10天和第17天pcDNA-IL-1Ra質粒組的外周血白細胞和血小板數均低于pcDNA3.1質粒對照組。通過該實驗我們認為,IL-1Ra可以影響小鼠骨髓的造血平衡。 質粒轉染作為基因治療的一種,雖然能夠有效的導入外源基因,但是對機體的損傷較大,并且表達時間和表達量都難以控制。因此我們采用有活性的重組小鼠IL-1Ra蛋白(rMuIL-1Ra)皮下注射的給藥方式進行該基因在小鼠骨髓造血系統(tǒng)中的功能研究。在正常小鼠中的量效實驗結果顯示,連續(xù)注射rMuIL-1Ra (1mg/kg) 5天后,除單核細胞外,IL-1Ra顯著降低小鼠骨髓細胞(BM cells)、外周血白細胞(WBC)、粒細胞(GR)、淋巴細胞(LY)的數量,且減少的細胞數量在5到10天恢復到rMuIL-1Ra注射前水平。結果證明IL-1Ra對正常小鼠造血功能具有可逆性抑制作用。 我們選取1mg/kg體重的劑量在正常小鼠中進行rMuIL-1Ra蛋白分別連續(xù)注射1天、3天、5天、7天、9天的時效實驗。連續(xù)注射rMuIL-1Ra蛋白1天、3天、5天的實驗組的骨髓細胞數逐漸下降,而繼續(xù)注射rMuIL-1Ra 7天至9天骨髓細胞數雖然仍低于對照組,但是比連續(xù)注射5天組有所上升。實驗結果表明,連續(xù)注射rMuIL-1Ra蛋白5天對正常小鼠骨髓細胞數的抑制最大。通過對該實驗中幾個時間點小鼠外周血血清中IL-1β水平的ELISA檢測,發(fā)現外源rMuIL-1Ra蛋白的注射可以影響小鼠體內IL-1β水平的變化。連續(xù)注射rMuIL-1Ra蛋白5天時,小鼠體內的IL-1β水平顯著上升,持續(xù)注射該蛋白5天以上小鼠體內IL-1β水平會回落至正常范圍。 接下來進一步研究rMuIL-1Ra對5-Fu化療小鼠造血系統(tǒng)的作用。我們進行了五個部分的實驗:(1) 5-Fu前2天或者5天預防性應用rMuIL-1Ra對化療小鼠骨髓損傷的保護作用; (2) 5-Fu后5天治療性應用rMuIL-1Ra對化療小鼠骨髓損傷的緩解作用; (3) 5-Fu前后各2天連續(xù)注射rMuIL-1Ra對小鼠血象的觀察比較; (4) 5-Fu后第7～10天連續(xù)注射rMuIL-1Ra對小鼠血象的觀察比較; (5)注射rMuIL-1Ra對5-Fu反復化療小鼠的骨髓保護作用。所有實驗組都設一個相應的無熱源PBS對照組,并且rMuIL-1Ra蛋白都是每天一次皮下注射。實驗結果顯示,5-Fu化療前的預防性應用和5-Fu化療后的治療性應用rMuIL-1Ra蛋白均對化療產生的骨髓損傷起到緩解作用。前四組實驗相對于對照組比較均在不同程度上促進了外周血血小板和骨髓細胞的恢復;5-Fu (280mg/kg)前2天連續(xù)注射rMuIL-1Ra可以使小鼠的存活率從70%提高到95%;亞致死劑量5-Fu (300mg/kg)前5天連續(xù)注射rMuIL-1Ra可以使小鼠的存活率從30%提高到75%;亞致死劑量300mg/kg的5-Fu后5天連續(xù)注射rMuIL-1Ra使小鼠存活率從20%提高到90%;5-Fu后第7～10天連續(xù)注射rMuIL-1Ra蛋白在第11天的外周血血小板的水平統(tǒng)計學上顯著的低于PBS對照組。rMuIL-1Ra對5-Fu反復化療的小鼠造血系統(tǒng)仍然能夠起到保護作用,體現在對外周血淋巴細胞,血小板恢復的促進和小鼠體重的恢復上。 關于IL-1Ra可以保護化療造成的骨髓損傷的機制研究,我們首先取正常小鼠連續(xù)5天皮下給藥rMuIL-1Ra后24h內處死小鼠,應用流式細胞儀檢測骨髓中不同造血細胞亞群細胞周期數據。骨髓單個核細胞(MNC)被逐級分為:未成熟細胞(Lin-,細胞不表達成熟血細胞表面標志);造血祖細胞(KL細胞,Lin- -c-kit);造血干細胞(SKL細胞,Sca-1+-c-kit+- Lin-)。結果顯示,處于S和G2/M期的4類細胞亞群均顯著減少;處于G1期的KL和SKL細胞均顯著減少,而G0期細胞相應顯著增多。我們的結論是:IL-1Ra作用的靶細胞是骨髓造血干細胞和造血祖細胞;rMuIL-1Ra注射小鼠后,驅使小鼠骨髓造血干/祖細胞進入細胞靜止期G0期,表現為G0期細胞增多,G1、S和G2/M期細胞減少。也就是說IL-1Ra的注射減緩了細胞周期的循環(huán)和細胞的增殖。這從機理上解釋了預防性應用rMuIL-1Ra于細胞周期特異性的化療藥物5-Fu之前,能夠減少骨髓細胞進入S期的數量從而對小鼠骨髓起到保護作用,緩解化療對骨髓的損傷。 其次,我們獲取5-Fu化療前預防性應用rMuIL-1Ra的小鼠骨髓,檢測其對造血祖細胞集落形成的影響。結果顯示,和對照組相比,正常小鼠連續(xù)5天注射MuIL-1Ra重組蛋白可以顯著的減少小鼠每條腿的骨髓造血祖細胞的集落數量。而化療之后的第3天和第7天,蛋白組造血祖細胞集落的數量都顯著高于對照組。 體內IL-1Ra的含量和IL-1β的水平是一個動態(tài)平衡的過程,如果IL-1在體內含量過高,機體會分泌更多IL-1Ra來拮抗IL-1,以恢復二者的平衡狀態(tài)。因此,我們運用ELISA的手段對化療小鼠不同時間連續(xù)注射rMuIL-1Ra蛋白后各個時間點小鼠體內的IL-1β的水平進行了檢測。結果顯示,在5-Fu后連續(xù)注射5天的實驗組中,小鼠外周血中的IL-1β的水平的升高相對于對照組和其它兩種給藥組明顯提前。其它幾組都是在第11天IL-1β的水平達到最高,而5-Fu后連續(xù)注射5天的實驗組的IL-1β的水平在第7天達到最高。這更確切地說明外源的rMuIL-1Ra蛋白的連續(xù)注射可以引起小鼠體內IL-1β水平的升高。這也解釋了在5-Fu后治療性應用rMuIL-1Ra蛋白可以對小鼠的血小板和骨髓的恢復起到促進作用。并且IL-1β水平的升高更可能是促進血小板恢復的重要原因。 綜合以上的研究結果,我們可以得出結論:應用rMuIL-1Ra蛋白可以促進化療引起的小鼠骨髓損傷的恢復;在5-Fu化療之前的預防性應用和之后的治療性應用rMuIL-1Ra蛋白都可以促進骨髓的恢復、顯著加快外周血血小板的恢復還大幅度的提高大劑量化療下小鼠的存活率。人和小鼠的IL-1Ra蛋白有高達78%的同源性,而且功能相似。因此本文的工作為開發(fā)基于IL-1Ra的人的化療保護藥物奠定了實驗基礎。
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【學位授予單位】：上海交通大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2008
【分類號】：R392

【參考文獻】

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本文編號：2480622