【摘要】：目的: 本實(shí)驗(yàn)在成功復(fù)制出人臍靜脈平滑肌細(xì)胞(human umbilical vein smooth muscle cells, HUSMCs)鈣化模型的基礎(chǔ)上,觀察血管緊張素-(1-7)[Angiotensin-(1-7), Ang-(1-7)]對HUSMCs鈣沉積的影響,探索Ang-(1-7)延緩或抑制HUSMCs鈣沉積的可能機(jī)制。 方法: 1. HUSMCs鈣化模型的復(fù)制采用不同濃度β-甘油磷酸鹽(β-GP)刺激體外培養(yǎng)的HUSMCs,分為5組(n=6):對照組(CON),終濃度為10mmol/L、12mmol/L、14mmol/L、16mmol/L的β-甘油磷酸鹽組(即10mmol/L組、12mmol/L組、14mmol/L組、16mmol/L組)。采用Von Kossa染色觀察HUSMCs鈣沉積情況,顯微圖像分析Von Kossa染色鈣化細(xì)胞百分比,磷酸苯二鈉法測定細(xì)胞中堿性磷酸酶(ALP)活性,甲基百里香酚藍(lán)法測定各組細(xì)胞中鈣含量,探尋β-GP復(fù)制HUSMCs鈣化模型的最佳濃度。 2.血管緊張素-(1-7)對HUSMCs鈣化的影響2.1.在成功復(fù)制HUSMCs鈣化模型基礎(chǔ)上,給予血管緊張素-(1-7)進(jìn)行干預(yù),分為6組(n=6):對照組(CON)、鈣化組(CAL)、單純血管緊張素-(1-7)組[Ang-(1-7)組]、鈣化+血管緊張素-(1-7)高劑量組[Ang-(1-7) H組]、鈣化+血管緊張素-(1-7)中劑量組[Ang-(1-7)M組]、鈣化+血管緊張素-(1-7)低劑量組[Ang-(1-7) L組]。 2.2.檢測方法①對細(xì)胞Von Kossa染色、顯微圖像分析、ALP活性和細(xì)胞鈣含量等指標(biāo)進(jìn)行檢測,觀察各組細(xì)胞鈣沉積情況。②酶聯(lián)免疫吸附法檢測細(xì)胞培養(yǎng)液中TGFβ1活性。③Western blot法檢測HUSMCs中核心結(jié)合因子1(core binding factorα1,Cbfα1)蛋白表達(dá)。④放射免疫技術(shù)檢測培養(yǎng)液中骨鈣素(OC)含量,觀察HUSMCs骨鈣素變化。 結(jié)果: 1. HUSMCs鈣化模型復(fù)制不同濃度β-GP誘導(dǎo)體外HUSMCs鈣化,Von Kossa染色結(jié)果顯示12mmol/L組大量HUSMCs呈菊花狀聚集生長,細(xì)胞聚集處可見棕褐色鈣結(jié)節(jié),顯微圖像分析系統(tǒng)定量計(jì)算結(jié)果發(fā)現(xiàn)12mmol/L組與CON組、10mmol/L組、14mmol/L組、16mmol/L組相比,鈣化細(xì)胞百分比明顯增加,細(xì)胞鈣含量和ALP活性均顯著升高,有顯著性差異。 2.血管緊張素-(1-7)對HUSMCs鈣化影響①Ang-(1-7)可明顯減少HUSMCs聚集生長,Von Kossa染色顯示細(xì)胞聚集處棕褐色鈣結(jié)節(jié)較CAL組明顯減輕(P0.01),Ang-(1-7)高、中、低劑量組鈣化細(xì)胞百分比、細(xì)胞鈣含量和ALP活性較CAL組明顯降低(均為P0.01)。②Ang-(1-7)高、中、低劑量組與CAL組相比細(xì)胞TGFβ1水平、cbfα1表達(dá)、骨鈣素含量均降低(分別P0.01)。 結(jié)論: 1.12mmol/Lβ-GP刺激HUSMCs10天,可成功復(fù)制體外HUSMCs鈣沉積模型。 2.采用顯微圖像分析系統(tǒng)可定量計(jì)算出Von Kossa染色鈣沉積情況,可作為鑒定Von Kossa染色鈣化的輔助方法。。 3、Ang-(1-7)可以減輕HUSMCs鈣化程度。 4、Ang-(1-7)通過影響TGFβ1-Smads-Cbfα1信號通路級聯(lián)效應(yīng),減弱信號通路中關(guān)鍵信號分子TGFβ1、Cbfα1表達(dá),發(fā)揮延緩HUSMCs鈣化的作用。
[Abstract]:Objective: to observe angiotensin-(1 鈮，

本文編號：2472484