【摘要】： 目的 1、構建及鑒定水動力法轉染HBV小鼠模型,探討該模型在HBV疫苗評價中的應用。 2、制備可誘導肝細胞特異性表達uPA轉基因小鼠,為人肝嵌合體小鼠模型的建立奠定基礎。 方法 1、復制型HBV小鼠模型的建立及其在疫苗評價中的應用 (1) pAAV-HBV1.3質粒的鑒定:含腺相關病毒倒轉末端重復序列元件與包含1.3個拷貝HBV基因組(ayw亞型)的HBV表達質粒pAAV-HBV1.3(由中國疾控中心病毒病所譚文杰教授惠贈),酶切鑒定并將該質粒轉染Huh7肝癌細胞系,ELISA方法檢測HBsAg、HBeAg的分泌表達水平。 (2)水動力法HBV小鼠模型的構建:將pAAV-HBV1.3質粒經高壓水動力法尾靜脈注射C57BL/6小鼠,分別于注射后10天、30天、60天采集血液和肝組織標本,ELISA檢測血清HBsAg、HBeAg表達;Real-Time PCR檢測血清及肝組織病毒載量;HE染色、免疫組化染色檢測肝組織病理學改變及病毒抗原在肝組織中的定位及表達。 (3)水動力法HBV小鼠模型的優(yōu)化:采用免疫抑制劑地塞米松注射液(DEX)腹腔注射小鼠,0.2ml/只/次(50mg/Kg)隔日一次連續(xù)3次,建立免疫功能抑制小鼠模型,在此基礎上制備乙肝病毒轉染小鼠模型,于注射后每周采集尾靜脈血,進行血清HBsAg、HBeAg檢測及病毒載量檢測。 (4)水動力法轉染HBV小鼠模型的鑒定:利用HBV商品化疫苗(商品名:安在時,成分:HBsAg)免疫小鼠,2μg/只,14天1次,共2次,生理鹽水為對照,200μl/只;第2次加強免疫14天后用水動力法轉染pAAV-HBV1.3,進行免疫保護性實驗,在不同時間點采集尾靜脈血,ELISA檢測血清HBsAg、HBeAg,Real-Time PCR檢測血清病毒載量。 (5)水動力法轉染HBV小鼠模型在疫苗評價中的應用:用重組腺病毒(AdS)免疫C57BL/6小鼠,同時設置安在時疫苗(商品化疫苗)及生理鹽水為對照。分別于首次免疫前及每次免疫后10天采集尾靜脈血,ELISA檢測血清HBsAb,最后1次免疫14天后尾靜脈水動力法注射pAAV-HBV1.3質粒溶液1.6m(l20μg/只),于不同時間點采集尾靜脈血,ELISA檢測血清HBsAg、HBeAg,Real-Time PCR檢測血清病毒載量。 2、可誘導肝細胞特異性表達uPA轉基因小鼠的制備 (1) pTet-on-Albumin轉基因小鼠的制備:構建及鑒定含血清白蛋白增強子和啟動子序列的pTet-on-Albumin載體,在細胞水平驗證Albumin啟動子轉錄活性,通過將pTet-on-Albumin載體顯微注射B6/CBA雜合一代受精卵原核細胞的方法獲得轉基因首建鼠,然后與野生型C57BL/6雜交,PCR篩選轉基因陽性小鼠,RT-PCR、Western blot鑒定rtTA mRNA及蛋白表達。 (2) pTRE2-uPA轉基因小鼠的制備:構建及鑒定含小鼠uPA基因的pTRE2- uPA載體,與pTet-on質粒共轉Huh7細胞系,細胞水平鑒定uPA的表達及其生物活性;通過將pTRE2-uPA載體顯微注射B6/CBA雜合一代受精卵原核細胞的方法獲得轉基因首建鼠,與野生型C57BL/6雜交,PCR篩選轉基因陽性小鼠。 (3)可誘導肝細胞特異性表達uPA轉基因小鼠的制備:將已獲得穩(wěn)定的且在小鼠肝細胞特異性表達Albumin-rtTA的轉基因小鼠與TRE2-uPA轉基因小鼠雜交,子代鼠Dox誘導,誘導12周后處死小鼠,取血清和肝組織進行ALT和肝組織uPA表達及病理學檢測,獲得可誘導肝細胞特異性表達uPA轉基因小鼠。 結果 1、復制型HBV小鼠模型的建立及其在疫苗評價中的應用 (1) pAAV-HBV1.3質粒的鑒定結果:將包含1.3倍全長HBV基因組的質粒pAAV-HBV1.3酶切分析與預期結果相符,pAAV-HBV1.3脂質體轉染Huh7細胞72h后收集細胞培養(yǎng)上清,ELISA方法檢測HBsAg、HBeAg均為陽性,OD值分別為0.309及1.279,對照(未轉染的Huh7細胞培養(yǎng)上清)均為陰性。 (2)水動力法HBV小鼠模型的鑒定結果:C57BL/6小鼠尾靜脈水動力法注射pAAV-HBV1.3,10天時通過ELISA方法檢測小鼠血清HBsAg、HBeAg,結果均為陽性,感染率為100%;30天、60天時血清HBsAg、HBeAg ELISA檢測結果均為陰性。Real-Time PCR檢測小鼠血清及肝組織病毒載量,結果顯示,注射質粒10天、30天及60天時實驗組小鼠血清及肝組織病毒載量明顯高于對照組,且在10天時達高峰,以后隨時間延長,血清及肝組織中病毒載量降低。免疫組化染色可見,10天時注射pAAV-HBV1.3小鼠肝組織均存在HBsAg、HBcAg陽性細胞,注射HBV質粒30天和60天時小鼠肝組織未檢測到HBsAg、HBcAg陽性細胞。 (3)水動力法HBV小鼠模型的優(yōu)化結果:免疫系統(tǒng)功能抑制小鼠在轉染pAAV-HBV1.3質粒后各組間HBsAg、HBeAg總體表達持續(xù)時間有顯著差異(P0.01,P0.05),且均為IP DEX 8周組表達最長,HBsAg和HBeAg在pAAV-HBV1.3轉染后第8周轉為陰性。結果顯示,通過抑制小鼠免疫狀態(tài),可明顯延長病毒在小鼠體內復制和表達時間。 (4) HBV商品化疫苗對水動力法轉染HBV小鼠模型鑒定結果:安在時疫苗免疫小鼠2次后即產生保護性抗體,pAAV-HBV1.3轉染后血清HBsAg、HBeAg均為陰性,生理鹽水組小鼠轉染pAAV-HBV1.3后血清HBsAg、HBeAg均為陽性。生理鹽水組小鼠轉染pAAV-HBV1.3后病毒載量明顯高于其他各組。實驗結果表明,高壓水動力法轉染HBV小鼠模型可有效應用于乙肝疫苗免疫效果的評價。 (5)水動力法轉染HBV小鼠模型用于新型疫苗評價的實驗研究:第2次加強免疫后安在時疫苗組HBsAb均為陽性,AdS組及生理鹽水組均為陰性,安在時組與其它兩組間差異顯著(P0.01,P0.01),第4次加強免疫后AdS組HBsAb全部轉為陽性,生理鹽水組HBsAb為陰性,兩組間差異顯著(P0.01);pAAV- HBV1.3質粒轉染后安在時疫苗組HBsAg、HBeAg均為陰性,AdS組HBsAg、HBeAg持續(xù)時間明顯短于生理鹽水組,兩組在10天、12天時HBsAg陽性率有顯著差異(P0.01,P0.05),在15天時HBeAg陽性率有顯著差異(P0.05)。Real-Time PCR結果顯示AdS組與生理鹽水組病毒載量明顯高于安在時疫苗組(P0.05 ,P0.05),AdS組與生理鹽水組轉染后20天病毒載量差異顯著(P0.05)。實驗結果表明,構建的表達HBV preS1-S-preS2的重組腺病毒候選疫苗可誘導產生一定的免疫保護作用,但免疫效果明顯不如商品化疫苗。該實驗同時也表明,水動力法轉染HBV小鼠模型在乙肝疫苗的免疫效果評價中有重要的應用價值。 2、可誘導肝細胞特異性表達uPA轉基因小鼠的制備 (1) pTet-on-Albumin轉基因小鼠的制備:構建四環(huán)素誘導表達系統(tǒng)肝組織特異性表達rt的調控質粒pTet-on- Albumin,經BamH I酶切可見4條帶(3026bp、2681bp、2000bp、1257bp),與pTRE2-EGFP共轉染Huh7細胞,Dox誘導24h,結果表明未誘導組沒有綠色熒光表達,而誘導組可見綠色熒光,細胞水平驗證Albumin啟動子具有轉錄活性。pTet-on- Albumin轉基因小鼠出生2周后提取基因組DNA,PCR陽性為轉基因首建鼠,與野生型C57BL/6小鼠交配,2周齡仔鼠剪尾提取基因組DNA,PCR檢測陽性為F1代小鼠,繁育獲得子代鼠,誘導后獲得子代鼠僅在肝組織檢測到rtTA mRNA及rtTA蛋白表達。 (2) pTRE2-uPA轉基因小鼠的制備:pTRE2-uPA質粒經SmaⅠ、HindⅢ雙酶切得4條帶(3549bp、1027bp、960bp和158bp),與pTet-on共轉染Huh7細胞,Dox誘導36h后提取轉染細胞總RNA,RT-PCR檢測uPA的表達,誘導組細胞擴增出1.3 kb的目地條帶;溶圈法檢測細胞培養(yǎng)上清中的uPA生物活性,除Dox誘導組細胞培養(yǎng)上清可觀察到溶圈現(xiàn)象,其他實驗組均未檢測到明顯的溶圈現(xiàn)象。pTRE2-uPA轉基因小鼠分別在出生2周后提取基因組DNA,PCR陽性為轉基因首建鼠,與野生型C57BL/6小鼠交配,2周齡仔鼠剪尾提取基因組DNA,PCR檢測陽性為F1代小鼠。 (3)可誘導肝細胞特異性表達uPA轉基因小鼠的制備:pTet-on-Albumin F1代小鼠與pTRE2-uPA F1代小鼠交配,PCR鑒定陽性為可誘導肝細胞特異性表達uPA雙轉基因小鼠,病理切片HE染色可見Dox誘導后肝組織點狀壞死灶,免疫組化結果可見肝細胞中散在的uPA表達。血清ALT結果為雙轉基因小鼠Dox誘導后ALT顯著高于未誘導組(P0.01)。結果顯示,成功制備可誘導肝細胞特異性表達uPA轉基因小鼠,并經過5代繁育,獲得pTet-on-Albumin-uPA雙轉基因純合子小鼠,目的基因表達穩(wěn)定。 結論 1、通過高壓水動力法建立了HBV轉染小鼠模型;通過抑制小鼠免疫狀態(tài),可延長病毒在肝組織內的復制與表達。 2、利用商品化疫苗進行HBV小鼠模型的鑒定,實驗表明該模型可以有效應用于疫苗評價;利用該模型對一種新型候選基因疫苗進行了評價。 3、成功制備了可誘導肝細胞特異性表達uPA轉基因小鼠模型,并獲得穩(wěn)定傳代的純合子小鼠,為HBV感染人肝嵌合體小鼠模型的建立奠定了基礎。
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【學位授予單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2010
【分類號】：R-332

【參考文獻】

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本文編號：2465888