【摘要】：鈉鈣交換體(NCX)是細胞膜上具有9個跨膜片段的一種,雙向轉(zhuǎn)運體,幾乎所有細胞均有NCX蛋白表達。生理情況下,NCX參與心肌細胞興奮收縮耦聯(lián)過程,參與神經(jīng)元中神經(jīng)遞質(zhì)的釋放,而在所有細胞中,NCX參與細胞內(nèi)鈣離子穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié)。與此同時,NCX還可能進行反向轉(zhuǎn)運參與眾多疾病的發(fā)生發(fā)展過程。因此,NCX具有極其重要的生理病理意義。目前,關(guān)于NCX活性調(diào)節(jié)和病理功能的研究甚多,但是關(guān)于蛋白磷酸化對NCX1活性的調(diào)節(jié),以及在缺血相關(guān)病理過程中NCX1的功能方面,人們所得到的結(jié)論并不完全一致,仍存在相互矛盾之處。因此,本實驗采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的方法將心臟型NCX1.1、大腦型NCX1.4和NCX1.5三種基因穩(wěn)定導入CHO細胞中,建立特異性表達NCX1.l、NCX1.4和NCX1,5三種亞型的細胞模型,以期研究蛋白激酶對不同組織來源的NCX1剪接產(chǎn)物的影響，同時探討NCX1在缺血.相關(guān)病理過程中的功能及篩選可能的NCX調(diào)節(jié)劑。 第一部分NCX1.1、NCX1.4和NCX1.5穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞株的構(gòu)建 我們首先利用酶切法對pcDNA3.1+質(zhì)粒載體上插入的NCX1.1、NCXl.4和NCX1.5基因的條帶大小進行鑒定。結(jié)果顯示NCX基因插入位點準確,條帶數(shù)目與大小符合理論值。此外,我們還將上述質(zhì)粒送交至Invitrogen和Takara公司進行測序,結(jié)果發(fā)現(xiàn)插入的NCX基因與GenBank中該基因目的序列完全一致。 隨后,我們采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將大鼠心臟NCX1.1、大鼠大腦NCX1.4及NCX1.5基因穩(wěn)定整合到CHO細胞內(nèi),用G418處理2-3周并篩選出單個克隆的高表達細胞株。經(jīng)鑒定,在野生型CHO-K1細胞中未檢測到有NCX蛋白的表達,而在3種穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的NCX細胞中大量表達有NCX蛋白,且表達水平相似。采用改變細胞內(nèi)外環(huán)境中Na+濃度的方法,用第二代鈣熒光指示劑Fura-2作為Ca2+探針,我們對上述細胞內(nèi)表達的NCX蛋白的生物活性進行了評估。結(jié)果顯示,用等摩爾NMDG+替換外液中的NaC1后,野生型CHO細胞的[Ca2+]i幾乎沒有改變,而3種CHO-NCX細胞的[Ca2+]i均顯著升高,提示去除細胞外鈉離子可以激活NCX反向轉(zhuǎn)運,進而說明細胞中表達的NCX蛋白具有生物學功能。 異硫脲衍生物KB-R7943是迄今發(fā)現(xiàn)的對NCX抑制作用較為特異的一種化合物,現(xiàn)己作為藥理學工具藥被廣泛用來研究生理病理狀態(tài)下NCX的作用。在本部分試驗中,我們進一步觀察了不同濃度的NCX抑制劑KB-R7943對上述3種穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的NCX細胞中NCX電流(INCX)的影響。結(jié)果顯示KB-R7943對3種NCXl選擇性剪接產(chǎn)物NCX1.1、NCX1.4和NCX1.5的內(nèi)外向電流均具有抑制作用,且呈現(xiàn)一定的劑量依賴性,但缺乏亞型選擇性。 本部分研究提示穩(wěn)定表達有大鼠心臟型NCX1.1、大鼠大腦型NCX1.4和NCX1.5三種亞型的細胞株構(gòu)建成功,為下一步對心臟和腦中的NCX1剪接產(chǎn)物的生理調(diào)節(jié)及病理功能的研究提供了良好的平臺。 第二部分蛋白磷酸化對NCX1.1、NCX1.4和NCX1.5反向轉(zhuǎn)運活性的影響 參與NCX活性調(diào)節(jié)的因素很多,如今研究已發(fā)現(xiàn)的包括單價、二價和三價陽離子,神經(jīng)遞質(zhì),激素和肽類物質(zhì)等。在眾多因素當中,蛋白磷酸化與NCX活性之間的相互關(guān)系依然沒有定論。為了單獨研究蛋白磷酸化對NCX功能的影響,我們采用穩(wěn)定轉(zhuǎn)染單一NCX亞型的CHO細胞作為平臺,觀察蛋白激酶C(PKC)和蛋白激酶A(PKA)對NCX反向轉(zhuǎn)運活性的影響。 在本部分研究中,我們首先評價了PKC激動劑Phorbol12-myristate13-acetate(PMA)和NCX抑制劑KB-R7943對野生型CHO細胞和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的NCX細胞中NCX反向轉(zhuǎn)運活性的影響。結(jié)果提示,在無Na+環(huán)境下,PKC激動劑PMA對野生型CHO細胞中[Ca2+]i無明顯影響。但是,心臟型NCX1.1的反向轉(zhuǎn)運卻可以為PKC激動劑PMA強烈激活,從而引起細胞內(nèi)出現(xiàn)大幅度的鈣瞬變,3μμM時激動作用達到最大,此時[Ca2+]i上升速率為23.82nM/sec,較對照組具有顯著升高。NCX抑制劑KB-R7943預(yù)孵育可以有效阻斷這種激動作用,從而說明細胞內(nèi)[Ca2+]i的升高確實經(jīng)由NCX介導。此外,Ca2+螯合劑EGTA可以有效消除穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的NCX1.1細胞中的鈣瞬變現(xiàn)象,該結(jié)果提示NCX介導的胞內(nèi)(Ca2+]i的升高與細胞外液中的Ca2+直接相關(guān)。雖然PKC激動劑PMA對大腦型NCX1.4和NCX1.5也具有一定的激動作用,但腦源性的NCX亞型對于PMA的敏感性較心臟型NCX1.1顯著降低,兩者相差達10倍以上。其中,僅10μM PMA對NCX1.5細胞反向轉(zhuǎn)運具有顯著激動作用,其[Ca2+]i上升速率較對照組細胞具有顯著升高。 此外,我們還觀察了PKA激動劑8-Bromoadenosine3',5'-cyclic momophoshate (8-Br cAMP)和NCX抑制劑KB-R7943對野生型CHO細胞和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的NCX細胞中NCX反向轉(zhuǎn)運活性的影響。結(jié)果提示,在無Na+環(huán)境下,PKA激動劑8-Br cAMP對野生型CHO細胞中[Ca2+]i不具有顯著的影響。但是,心臟型NCXl.1的反向轉(zhuǎn)運卻可以為PKA激動劑8-Br cAMP強烈激活,從而引起細胞內(nèi)出現(xiàn)大幅度的鈣振蕩現(xiàn)象。NCX抑制劑KB-R7943預(yù)孵育可以有效阻斷這種激動作用,從而說明細胞內(nèi)[Ca2+]i的升高確實經(jīng)由NCX介導。此外,Ca2+螫合劑EGTA可以有效消除穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的NCX1.1細胞中的鈣振蕩現(xiàn)象,該結(jié)果提示NCX介導的胞內(nèi)[Ca2+]i的升高與細胞外液中的Ca2+直接相關(guān)。PKA激動劑8-Br cAMP對大腦型NCX1.4和NCX1.5的激動作用與心肌型NCXl.1類似,低濃度(101μM)的8-Br cAMP即可以引起上述細胞胞內(nèi)出現(xiàn)顯著的鈣振蕩。 本部分研究提示PKC和PKA均參與了心肌型NCXl.1、大腦型NCX1.4和NCX1.5的反向轉(zhuǎn)運活性的調(diào)節(jié),不同的是,大腦型NCX1.4和NCX1.5對PKC激動劑PMA的敏感性較心臟型NCXl.1低10倍以上,從而提示PKC蛋白磷酸化對不同組織來源的NCX1剪接產(chǎn)物的調(diào)節(jié)作用程度不 第三部分NCX在缺血相關(guān)病理模型中作用的研究 1.H2O2損傷模型中NCX作用的研究 我們首先評價了H2O2損傷對野生型和轉(zhuǎn)基因細胞生存率的影響。利用MTT方法,我們發(fā)現(xiàn)H2O2損傷24小時可以引起野生型和轉(zhuǎn)基因細胞的細胞生存率出現(xiàn)濃度依賴性的下降,其中70μM H2O2損傷24小時后,NCX1.4和NCX1.5細胞的存活率分別為45.1%和44.0%,較野生型細胞75.3%的存活顯著降低。利用Hoechst33342和PI雙重熒光染色方法檢測細胞死亡,結(jié)果顯示轉(zhuǎn)基因細胞在70μM H2O2損傷24小時后,穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的NCX1.1、NCX1.4和NCX1.5細胞的死亡率分別為32.7%、49.5%和52.7%,與野生型CHO細胞24.2%的死亡率相比,穩(wěn)定轉(zhuǎn)染了NCX基因的三種細胞的死亡率都具有疆著性的升高。隨后,我們還采用鈣成像技術(shù)實時監(jiān)測H202損傷后各組細胞胞內(nèi)[Ca2+]i的動態(tài)變化過程,結(jié)果顯示,野生型CHO細胞胞內(nèi)的[Ca2+]i升高幅度較低,上升速率較慢。本部分研究提示在氧化損傷模型中,氧自由基可以導致細胞內(nèi)鈣外排系統(tǒng)紊亂,細胞胞內(nèi)[Ca2+]i升高,而H2O2還可以進一步激活NCX反向轉(zhuǎn)運,加劇細胞損傷。 2.酸中毒模型中NCX作用的研究 類似的,我們首先評價了中度酸中毒損傷(pH6.4)對野生型和轉(zhuǎn)基因細胞生存率的影響。利用MTT方法,我們發(fā)現(xiàn)pH6.4的細胞外液損傷可以引起野生型和轉(zhuǎn)基因細胞的細胞生存率出現(xiàn)時間依賴性的下降,其中pH6.4的細胞外液損傷24小時后,NCX1.1、NCX1.4和NCX1.5細胞的存活率分別為55.2%、62.5%和61.3%,較野生型細胞48.2%的存活顯著升高。利用Hoechst33342和PI雙重熒光染色方法檢測細胞死亡,結(jié)果顯示轉(zhuǎn)基因細胞在pH6.4的細胞外液損傷24小時后,穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的NCX1.1、NCX1.4和NCX1.5細胞的死亡率分別為20.7%、22.7%和23.2%,與野生型CHO細胞333%的死亡率相比,穩(wěn)定轉(zhuǎn)染了NCX基因的二種細胞的死亡率都具有顯著性的降低。隨后,我們還采用鈣成像技術(shù)實時監(jiān)測各組細胞在pH6.4的環(huán)境下其胞內(nèi)[Ca2+]i的動態(tài)變化過程,結(jié)果顯示,野生型CHO細胞胞內(nèi)的[Ca2+]i隨酸化時間的延長而逐漸升高,而NCX轉(zhuǎn)染細胞胞內(nèi)[Ca2+]i輕微下降或者基本維持不變。本部分研究提示在酸中毒損傷模型中,由于未去除細胞外液中的葡萄糖,因而細胞的能量供應(yīng)正常,NCX可以以正向轉(zhuǎn)運的方式排出細胞內(nèi)的鈣離子,從而發(fā)揮細胞保護作用。 3. Ca2+paradox模型中NCX作用的研究 我們首先采用無鈣細胞外液孵育野生型和轉(zhuǎn)基因細胞1小時,然后復(fù)灌標準細胞外液、中鈣(2.5mM)及高鈣(3.8mM)三種不同鈣離子濃度的細胞外液,孵育不同時間后評價鈣反常損傷對野生型和轉(zhuǎn)基因細胞生存率的影響。 利用MTT方法,我們發(fā)現(xiàn)復(fù)灌標準細胞外液、中鈣(2.5mM)及高鈣(3.8mM)三種不同鈣離子濃度的細胞外液構(gòu)建鈣反常損傷時,野生型和轉(zhuǎn)基因細胞的生存率均出現(xiàn)時間依賴性的下降。 復(fù)灌標準細胞外液24小時后,NCX1.1、NCXl.4和NCX1.5細胞的存活率分別為79.2%、80.3%和81.6%,較野生型細胞64.7%的存活顯著升高。利用Hoechst33342和PI雙重熒光染色方法檢測細胞死亡,結(jié)果顯示轉(zhuǎn)基因細胞在復(fù)灌標準細胞外液24小時后,穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的NCX1.1、NCX1.4和NCX1.5細胞的死亡率分別為19.4%、25.4%和21.4%,與野生型CHO細胞29.9%的死亡率相比,穩(wěn)定轉(zhuǎn)染了NCX基因的三種細胞的死亡率都具有顯著性的降低。 復(fù)灌含有2.5mM鈣離子的細胞外液24小時后,NCX1.1、NCX1.4和NCX1.5細胞的存活率分別為83.0%、83.3%和80.9%,較野生型細胞68.0%的存活顯著升高。利用Hoechst33342IPI雙重熒光染色方法檢測細胞死亡,結(jié)果顯示轉(zhuǎn)基因細胞在復(fù)灌含有2.5mM鈣離子的細胞外液24小時后,穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的NCX1.1、NCX1.4和NCX1.5細胞的死亡率分別為23.2%、28.6%和23.8%,與野生型CHO細胞29.4%的死亡率相比,穩(wěn)定轉(zhuǎn)染了NCX基因的三種細胞的死亡率都具有顯著性的降低。 復(fù)灌含有3.8mM鈣離子的細胞外液24小時后,NCX1.1、NCX1.4和NCX1.5細胞的存活率分別為77.4%、75.2%和73.2%,較野生型細胞54.90%的存活顯著升高。利用Hoechst33342和PI雙重熒光染色方法檢測細胞死亡,結(jié)果顯示轉(zhuǎn)基因細胞在復(fù)灌含有3.8mM鈣離子的細胞外液24小時后,穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的NCX1.l、NCX1.4和NCX1.5細胞的死亡率分別為31.2%、35.8%和32.8%,與野生型CHO細胞51.3%的死亡率相比,穩(wěn)定轉(zhuǎn)染了NCX基因的三種細胞的死亡率都具有顯著性的降低。 隨后,我們還采用鈣成像技術(shù)實時監(jiān)測各組細胞在Ca2+paradox過程中胞內(nèi)[Ca2+]i的動態(tài)變化過程,結(jié)果顯示,灌流無鈣液后,野生型細胞內(nèi)[Ca2+]i未見顯著改變,而穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的NCX細胞[Ca2+]i現(xiàn)雖然輕微,但是卻具有顯著性的降低,這種胞內(nèi)[Ca2+]i的降低主要由NCX正向轉(zhuǎn)運介導。有鈣液復(fù)灌1小時后野生型CHO細胞胞內(nèi)的[Ca2+]i隨時間延長而逐漸升高,而NCX轉(zhuǎn)染細胞胞內(nèi)[Ca2+]i出現(xiàn)較為恒定的平臺期。本部分研究提示在鈣反常模型中,復(fù)灌有鈣液可以導致細胞內(nèi)[Ca2+]i急劇上升,從而激活NCX正向轉(zhuǎn)運,其通過降低胞內(nèi)的鈣離子濃度而發(fā)揮細胞保護作用。 在本部分研究中,我們以穩(wěn)定轉(zhuǎn)染NCX基因的細胞株作為平臺,從氧化應(yīng)激損傷,酸中毒損傷和鈣超載損傷既相互關(guān)聯(lián)卻又不完全相同的三個方面模擬缺血相關(guān)病理過程,觀察心臟型NCX1.1以及大腦型NCX1.4和NCX1.5在上述疾病模型中所發(fā)揮的功能。該部分結(jié)果提示,NCX在不同的損傷環(huán)境中具有不同的轉(zhuǎn)運方式,從而發(fā)揮細胞保護或者起到加重損傷的作用。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學院
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2010
【分類號】：R363

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本文編號：2465335