【摘要】： 母-胎界面滋養(yǎng)細(xì)胞具有獨(dú)特的類(lèi)似于腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)行為,即高增殖和侵襲能力。滋養(yǎng)細(xì)胞增殖與侵襲對(duì)于囊胚植入、胎盤(pán)發(fā)育,并建立恰當(dāng)?shù)哪?胎關(guān)系至關(guān)重要。滋養(yǎng)細(xì)胞增殖與侵襲功能障礙是子癇前期、胎兒宮內(nèi)生長(zhǎng)受限(FGR)、自然流產(chǎn)等妊娠相關(guān)疾病的主要原因。但在正常妊娠,滋養(yǎng)細(xì)胞很少發(fā)生無(wú)限制增殖和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移,提示可能受到細(xì)胞間直接或間接的分子調(diào)控,使其促侵襲和抑制侵襲維持生理性動(dòng)態(tài)平衡。母-胎界面微環(huán)境細(xì)胞與分子間的相互作用可以調(diào)節(jié)滋養(yǎng)細(xì)胞侵入子宮內(nèi)膜及蛻膜。因此,母-胎界面參與調(diào)控滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲力的關(guān)聯(lián)分子,可以影響胚泡的正常植入和生長(zhǎng)。 CD82蛋白是一種廣泛表達(dá)的Tetraspanin超家族跨膜糖蛋白,是經(jīng)典的腫瘤細(xì)胞侵襲抑制基因。已有研究證實(shí)CD82是細(xì)胞遷移的一個(gè)重要調(diào)節(jié)蛋白,CD82低表達(dá)與腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移相關(guān),致使多種晚期惡性腫瘤的不良預(yù)后。因此我們推測(cè)CD82可能參與母-胎界面滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲能力的調(diào)控；解析CD82在母-胎界面的作用機(jī)制,及解析調(diào)控CD82表達(dá)的相關(guān)蛋白和基因?qū)⒂兄陉U明生理狀態(tài)下胚泡植入和病理性滋養(yǎng)細(xì)胞疾病的發(fā)病機(jī)制,對(duì)治療滋養(yǎng)細(xì)胞疾病亦具有潛在的臨床應(yīng)用價(jià)值。 本研究在前期工作基礎(chǔ)上,進(jìn)一步關(guān)注CD82作用于人早孕期滋養(yǎng)細(xì)胞的分子機(jī)制,擬闡明CD82對(duì)滋養(yǎng)細(xì)胞功能調(diào)控的分子機(jī)制；CD82表達(dá)調(diào)控,及其在母-胎界面促進(jìn)滋養(yǎng)細(xì)胞和蛻膜基質(zhì)細(xì)胞交叉對(duì)話(huà),調(diào)節(jié)滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲能力的分子機(jī)制。 目的分析CD82在正常和早期妊娠失敗母-胎界面的表達(dá)及其表達(dá)調(diào)控。 方法收集人早孕期正常或不明原因自然流產(chǎn)的絨毛與蛻膜組織,應(yīng)用本實(shí)驗(yàn)室建立的胰酶消化、密度梯度離心法分離、培養(yǎng)正常人早孕期滋養(yǎng)細(xì)胞和蛻膜基質(zhì)細(xì)胞(DSCs)。采用RT-PCR、定量real-time RT-PCR、免疫組織化學(xué)、免疫細(xì)胞化學(xué)和傳統(tǒng)免疫印跡雜交法,分別檢測(cè)母-胎界面CD82的表達(dá),比較分析CD82在正常早孕與早期妊娠失敗母-胎界面的表達(dá)差異。對(duì)原代培養(yǎng)的蛻膜基質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行多種干預(yù),包括妊娠相關(guān)激素和炎性介質(zhì),用in-cell Western檢測(cè)蛻膜基質(zhì)細(xì)胞CD82的表達(dá)。 結(jié)果原代蛻膜基質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)錄、翻譯CD82；而原代滋養(yǎng)細(xì)胞不轉(zhuǎn)錄和翻譯CD82。從mRNA和蛋白水平分析蛻膜組織中CD82的表達(dá)水平,發(fā)現(xiàn)正常早孕期蛻膜明顯低于早期妊娠失敗的蛻膜。生理濃度范圍hCG能下調(diào)蛻膜基質(zhì)細(xì)胞表達(dá)CD82(以10kU/L濃度作用最佳)；單獨(dú)生理濃度孕激素和17β雌二醇對(duì)蛻膜基質(zhì)細(xì)胞表達(dá)CD82無(wú)明顯調(diào)節(jié)作用；但孕激素可以協(xié)同hCG進(jìn)一步下調(diào)蛻膜基質(zhì)細(xì)胞表達(dá)CD82。LPS促進(jìn)蛻膜基質(zhì)細(xì)胞表達(dá)CD82; IL-1β中和性抗體能拮抗LPS對(duì)蛻膜基質(zhì)細(xì)胞表達(dá)CD82的促進(jìn)作用。 結(jié)論CD82在人早孕期母-胎界面蛻膜基質(zhì)細(xì)胞表達(dá),明顯低于早期妊娠失敗蛻膜,提示母-胎界面CD82異常表達(dá)可導(dǎo)致妊娠失敗。hCG下調(diào)蛻膜基質(zhì)細(xì)胞表達(dá)CD82,提示CD82與正常妊娠有關(guān),并可能參與控制滋養(yǎng)細(xì)胞疾病的發(fā)生、發(fā)展；LPS通過(guò)刺激炎性介質(zhì)IL-1β的分泌,上調(diào)CD82的表達(dá),提示CD82可介導(dǎo)炎癥導(dǎo)致的自然流產(chǎn)。 目的解析CD82在人早孕期母-胎界面的生物學(xué)功能。 方法原代培養(yǎng)人早孕期蛻膜基質(zhì)細(xì)胞和滋養(yǎng)細(xì)胞,利用siRNA干擾技術(shù),成功沉默蛻膜基質(zhì)細(xì)胞CD82的表達(dá),并建立直接或間接共培養(yǎng)體系；利用質(zhì)粒pCNA3.1(+)-CD82轉(zhuǎn)染滋養(yǎng)細(xì)胞腫瘤細(xì)胞系BeWo,成功實(shí)現(xiàn)BeWo細(xì)胞過(guò)表達(dá)CD82。蛻膜基質(zhì)細(xì)胞經(jīng)沉默CD82后,與原代滋養(yǎng)細(xì)胞共培養(yǎng),此后采用Matrigel侵襲試驗(yàn)分析滋養(yǎng)細(xì)胞的侵襲力。分析BeWo細(xì)胞經(jīng)轉(zhuǎn)染CD82后的侵襲力；分別用定量real-time RT-PCR、in-cell Western和免疫熒光法分析蛻膜基質(zhì)細(xì)胞沉默CD82后,及BeWo細(xì)胞過(guò)表達(dá)CD82后,侵襲相關(guān)分子的mRNA和蛋白表達(dá)水平。 結(jié)果蛻膜基質(zhì)細(xì)胞經(jīng)CD82沉默后,與原代滋養(yǎng)細(xì)胞共培養(yǎng),使滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲力明顯增強(qiáng)；蛻膜基質(zhì)細(xì)胞表達(dá)TIMP1明顯下調(diào),integrinβ1和integrinavP3表達(dá)明顯上調(diào)；而MMP2、MMP9、TIMP2和titin表達(dá)無(wú)明顯改變。相反,轉(zhuǎn)染CD82的BeWo細(xì)胞侵襲力明顯減弱,TIMP1表達(dá)明顯上調(diào),integrinβ1和integrinαvβ3表達(dá)明顯下調(diào)；同樣,MMP2、MMP9、TIMP2和titin表達(dá)無(wú)明顯差異。 結(jié)論蛻膜基質(zhì)細(xì)胞表達(dá)CD82或滋養(yǎng)細(xì)胞過(guò)表達(dá)CD82均可控制滋養(yǎng)細(xì)胞的侵襲力,通過(guò)升調(diào)節(jié)TIMP1表達(dá),實(shí)現(xiàn)滋養(yǎng)細(xì)胞與蛻膜基質(zhì)細(xì)胞的交叉對(duì)話(huà)。 目的探討CD82調(diào)節(jié)人滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲性的信號(hào)通路。 方法應(yīng)用siRNA轉(zhuǎn)染蛻膜基質(zhì)細(xì)胞沉默CD82的表達(dá)；質(zhì)粒轉(zhuǎn)染BeWo細(xì)胞過(guò)表達(dá)CD82,然后分析沉默及過(guò)表達(dá)CD82對(duì)侵襲相關(guān)的關(guān)鍵信號(hào)通路分子表達(dá)的調(diào)控作用。為了分析CD82抑制滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲能性的信號(hào)通路,建立蛻膜基質(zhì)細(xì)胞和原代滋養(yǎng)細(xì)胞共培養(yǎng)體系,及BeWo細(xì)胞單獨(dú)培養(yǎng)體系,分別加入integrinβ1中和性抗體或MAPK/ERK信號(hào)通路阻斷劑U0126,用Matrigel侵襲試驗(yàn)分析各組滋養(yǎng)細(xì)胞的侵襲力,以解析integrinβ1和MAPK/ERK1/2信號(hào)通路在CD82調(diào)節(jié)人早孕期滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲中的作用；繼而用in-cell Western分析各組TIMP1蛋白表達(dá)水平。 結(jié)果在蛻膜基質(zhì)細(xì)胞與原代滋養(yǎng)細(xì)胞共培養(yǎng)系統(tǒng)中,蛻膜基質(zhì)細(xì)胞經(jīng)沉默CD82后,使滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲力明顯增加,pERK1/2與總ERK1/2的比值明顯升高,integrinβ1表達(dá)明顯增加,TIMP1表達(dá)明顯下降；而integrinβ1中和性抗體和U0126則明顯降低滋養(yǎng)細(xì)胞的侵襲力,能逆轉(zhuǎn)CD82沉默對(duì)滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲力的增強(qiáng)作用,解除對(duì)磷酸化ERK1/2的升調(diào)節(jié)作用,提示蛻膜基質(zhì)細(xì)胞表達(dá)CD82通過(guò)抑制integrinβ1/MAPK/ERK1/2信號(hào)通路,控制人早孕期滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲。integrinβ1中和性抗體和U0126處理也能有效逆轉(zhuǎn)CD82對(duì)TIMP1表達(dá)的升調(diào)作用。同樣,轉(zhuǎn)染CD82的BeWo細(xì)胞經(jīng)integrinβ1中和性抗體和U0126處理也呈現(xiàn)類(lèi)似效果。TIMP1的表達(dá)水平與滋養(yǎng)細(xì)胞細(xì)胞的侵襲力呈直線(xiàn)負(fù)相關(guān)。 結(jié)論因此,CD82主要通過(guò)抑制integrinβ1/MAPK/ERK1/2信號(hào)通路,促進(jìn)人早孕期蛻膜基質(zhì)細(xì)胞表達(dá)TIMP1,上調(diào)的TIMP1依次抑制滋養(yǎng)細(xì)胞的侵襲能力。 目的分析人早孕期母-胎界面SDF-1/CXCR4對(duì)CD82表達(dá)調(diào)節(jié)作用。 方法收集人早孕期正常蛻膜和絨毛組織,對(duì)原代蛻膜基質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行多種干預(yù),包括原代滋養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)上清、重組人SDF-1、重組人CCL2、抗人SDF-1、CXCR4、CCL2中和性抗體或CCR2拮抗劑。用in-cell Western檢測(cè)蛻膜基質(zhì)細(xì)胞CD82的表達(dá)。同時(shí)建立蛻膜基質(zhì)細(xì)胞和原代滋養(yǎng)細(xì)胞共培養(yǎng)體系,同時(shí)引入抗人CXCR4中和性抗體,Matrigel侵襲試驗(yàn)分析共培養(yǎng)體系滋養(yǎng)細(xì)胞的侵襲力。 結(jié)果滋養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)上清促進(jìn)蛻膜基質(zhì)細(xì)胞表達(dá)CD82；重組人SDF-1亦促進(jìn)蛻膜基質(zhì)細(xì)胞表達(dá)CD82; SDF-1或CXCR4中和性抗體可抑制滋養(yǎng)細(xì)胞上清對(duì)蛻膜基質(zhì)細(xì)胞表達(dá)CD82的升調(diào)節(jié)作用。CXCR4中和性抗體直接處理滋養(yǎng)細(xì)胞明顯降低其侵襲力；但CXCR4中和性抗體預(yù)處理蛻膜基質(zhì)細(xì)胞后,共培養(yǎng)體系中滋養(yǎng)細(xì)胞的侵襲力明顯增加；CXCR4中和性抗體分別預(yù)處理滋養(yǎng)細(xì)胞和蛻膜基質(zhì)細(xì)胞后,共培養(yǎng)體系的滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲力降低。此外,CXCR4中和性抗體預(yù)處理蛻膜基質(zhì)細(xì)胞可以解除CD82對(duì)滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲力的抑制作用。 結(jié)論人早孕期母-胎界面滋養(yǎng)細(xì)胞分泌SDF-1,通過(guò)白分泌方式促進(jìn)自身侵襲；通過(guò)旁分泌升調(diào)節(jié)蛻膜基質(zhì)細(xì)胞表達(dá)CD82,控制滋養(yǎng)細(xì)胞的過(guò)度侵襲,使其侵襲力維持在正常適度范圍,借此介導(dǎo)母-胎界面滋養(yǎng)細(xì)胞與蛻膜基質(zhì)細(xì)胞的交叉對(duì)話(huà)。 目的分析CsA調(diào)控母-胎界面CD82表達(dá)和滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲力的分子機(jī)制。 方法收集人早孕期正常蛻膜和絨毛組織,用CsA處理原代蛻膜基質(zhì)細(xì)胞,或滋養(yǎng)細(xì)胞經(jīng)CsA預(yù)處理后收獲培養(yǎng)上清；用抗人SDF-1或CXCR4中和性抗體處理蛻膜基質(zhì)細(xì)胞,然后用in-cell Western檢測(cè)蛻膜基質(zhì)細(xì)胞CD82的表達(dá)。于滋養(yǎng)細(xì)胞和蛻膜基質(zhì)細(xì)胞的單獨(dú)和共培養(yǎng)體系加入CsA, ELISA法分析培養(yǎng)上清中SDF-1的分泌；用抗人CXCR4中和性抗體分別預(yù)處理蛻膜基質(zhì)細(xì)胞和/或滋養(yǎng)細(xì)胞后,然后進(jìn)行共培養(yǎng),在加入CsA后,Matrigel侵襲試驗(yàn)分析共培養(yǎng)體系滋養(yǎng)細(xì)胞的侵襲力。 結(jié)果CsA對(duì)蛻膜基質(zhì)細(xì)胞表達(dá)CD82無(wú)直接調(diào)節(jié)作用；但CsA能加強(qiáng)滋養(yǎng)細(xì)胞上清對(duì)蛻膜基質(zhì)細(xì)胞表達(dá)CD82的促進(jìn)作用；低濃度CsA能促進(jìn)滋養(yǎng)細(xì)胞和共培養(yǎng)體系SDF-1的分泌；抗人SDF-1或CXCR4中和性抗體能抑制CsA通過(guò)滋養(yǎng)細(xì)胞對(duì)蛻膜基質(zhì)細(xì)胞表達(dá)CD82的間接促進(jìn)作用。在加入CsA的共培養(yǎng)體系中,抗人CXCR4中和性抗體預(yù)處理蛻膜基質(zhì)細(xì)胞可以部分逆轉(zhuǎn)CD82對(duì)滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲力的抑制作用。 結(jié)論CsA促進(jìn)滋養(yǎng)細(xì)胞分泌SDF-1,放大人早孕期母-胎界面滋養(yǎng)細(xì)胞對(duì)蛻膜基質(zhì)細(xì)胞表達(dá)CD82的促進(jìn)作用；CD82進(jìn)而抑制滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲能力。因此,CsA可協(xié)調(diào)母-胎界面滋養(yǎng)細(xì)胞與蛻膜基質(zhì)細(xì)胞之間的交叉對(duì)話(huà)。 綜上所述,本研究發(fā)現(xiàn)CD82對(duì)人早孕期母-胎界面具有多重調(diào)節(jié)作用：(1)通過(guò)抑制integrinβ1/MAPK/ERK1/2信號(hào)通路促進(jìn)TIMP1表達(dá),抑制滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲；(2)蛻膜基質(zhì)細(xì)胞通過(guò)表達(dá)CD82,控制滋養(yǎng)細(xì)胞過(guò)度侵襲；(3)蛻膜基質(zhì)細(xì)胞CD82過(guò)表達(dá)可導(dǎo)致早期妊娠失敗；(4)滋養(yǎng)細(xì)胞通過(guò)分泌SDF-1促進(jìn)蛻膜基質(zhì)細(xì)胞表達(dá)CD82,促進(jìn)人早孕期母-胎界面滋養(yǎng)細(xì)胞和蛻膜基質(zhì)細(xì)胞之間的交叉對(duì)話(huà),適度控制滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲能力；(5)CsA通過(guò)促進(jìn)滋養(yǎng)細(xì)胞分泌SDF-1,升調(diào)節(jié)蛻膜基質(zhì)細(xì)胞表達(dá)CD82,參與滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲能力的精密調(diào)控。此外,人早孕期母胎界面CD82的表達(dá)還受妊娠相關(guān)激素的調(diào)控。本研究為完善滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲調(diào)控機(jī)制,及臨床治療反復(fù)自然流產(chǎn)等相關(guān)妊娠疾病提供了新策略與新思路。
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【學(xué)位授予單位】：復(fù)旦大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類(lèi)號(hào)】：R321

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2461423