【摘要】： 面對全球嚴峻的結核病耐藥狀況,到目前為止,還沒有理想的新型抗結核藥物進入臨床應用,人類急需發(fā)現新的藥物作用靶點、新的藥物篩選模型以致最終完成新型的抗結核藥物研制。分枝桿菌噬菌體具有裂解結核分枝桿菌的作用,具有治療結核病的潛在價值,能否成為一個抗結核病的新藥,也倍受關注。結核病最常見的感染臟器為肺臟,目前已有的噬菌體治療結核分枝桿菌研究的給藥方式為皮下注射、滴鼻途徑,噬菌體到達肺臟的有效劑量低,如果采用氣溶膠吸入給藥途徑,可能效果會更好,分枝桿菌噬菌體氣溶膠吸入治療結核分枝桿菌是一個值得深入研究的領域。 噬菌體D29氣溶膠的粒子大小、粒徑分布以及耐霧化能力是其能否使用氣溶膠吸入給藥治療的關鍵。DV40發(fā)生器不同介質發(fā)生的氣溶膠動力學直徑為0.8微米左右。TSI3321測試的噬菌體D29氣溶膠總粒子空氣動力學直徑為0.872微米,Anderson六級采樣器采集的生物粒子氣溶膠的質量中值直徑為2.21微米,噬菌體D29在噴霧流量10L/min,壓力1.8kg/cm2,發(fā)生液介質為PBS磷酸鹽緩沖液的條件下霧化30分鐘存活率為48.86%、霧化60分鐘存活率為30.12%,具有較強的耐霧化能力。每分鐘的噴霧量為232μl。在此條件下產生的氣溶膠生物粒子的質量中值直徑為2.21微米,可以進入肺臟,在此條件下發(fā)生的氣溶膠可以滿足動物氣溶膠吸入研究的要求。AGI-10液體沖擊式采樣器加入消泡劑橄欖油后可以提高噬菌體D29的耐沖擊能力,但噬菌體D29的絕對數量比不加的要少,因此AGI-10液體沖擊式采樣器采樣時不加消泡劑橄欖油。 傳統(tǒng)的結核分枝桿菌噬菌體D29的定量檢測方法為雙層瓊脂培養(yǎng)法,從宿主菌的培養(yǎng)到雙層瓊脂培養(yǎng)計數,即使使用快速生長恥垢分枝桿菌作為宿主菌,整個過程也要4-5天,快速檢測方法對于噬菌體D29氣溶膠治療結核分枝桿菌的相關研究具有重要意義。SYBR greenⅠ熒光染料方法簡便易行、價格便宜。Ct值(Y)和對數濃度lgN(X)的直線方程為:Y=-3.08X+37.46,誤差為0.026,相關系數為-0.996。本研究中氣溶膠樣本QPCR的檢測結果是雙層瓊脂計數法的78.19倍,QPCR檢測結果明顯高于培養(yǎng)法的結果。而在噬菌體D29新鮮的液體樣本中QPCR法和培養(yǎng)法的符合性較好。檢測的靈敏度為10~1PFU/反應。QPCR方法可以大大提高定量速度,從采集樣本到得到檢測結果只要3-4小時。 氣溶膠吸入治療、免疫及藥效評價的實驗室研究離不開動物氣溶膠暴露技術平臺,該技術平臺是上述研究工作的基礎。呼吸道氣溶膠吸入是病原微生物感染的重要途徑,氣溶膠吸入病原微生物往往產生不同于傳統(tǒng)感染途徑的病癥,病情嚴重,且傳統(tǒng)疫苗對吸入感染的保護效果較差。研制新型有效的疫苗和治療藥物需要病原微生物氣溶膠攻毒感染途徑,建立病原微生物氣溶膠感染動物模型。目前市場上只有動物全身暴露氣溶膠系統(tǒng),由于全身暴露的種種缺陷,研究人員更多的使用動物口鼻氣溶膠暴露系統(tǒng)。由于動物口鼻暴露系統(tǒng)的工藝較復雜,且屬于多學科交叉,目前各研究單位如:美國陸軍傳染病研究所使用的全自動生物氣溶膠暴露系統(tǒng)全部為自制。為了建立動物氣溶膠暴露技術平臺,滿足動物氣溶膠感染、暴露動物實驗的需要。建立了由潔凈壓縮空氣系統(tǒng)、氣溶膠發(fā)生系統(tǒng)、補氣系統(tǒng)、氣溶膠采樣分析系統(tǒng)、動物暴露裝置、污染氣流凈化系統(tǒng)等組成的動物口鼻氣溶膠暴露技術平臺。 對建立的動物氣溶膠暴露系統(tǒng),進行了所有氣溶膠粒子和生物氣溶膠粒子分布是否均勻的評價。使用粘質沙雷氏菌8039和噬菌體D29氣溶膠,TSI3321氣溶膠測試儀測試了所有粒子分布情況,微生物采樣器檢測生物粒子氣溶膠的分布情況,無論生物粒子氣溶膠還是所有粒子氣溶膠的采樣結果表明暴露裝置上下層和每層各暴露口之間氣溶膠濃度差異不顯著。對各種微生物氣溶膠濃度的采樣方法進行了研究,發(fā)生高濃度微生物氣溶膠時,由于濃度過高,超出了Anderson六級采樣器的定量限度,應使用AGI-10液體沖擊式采樣器;發(fā)生中濃度氣溶膠,Anderson六級空氣微生物采樣器的采樣結果顯著高于AGI-10液體沖擊式采樣器,應使用Anderson六級空氣微生物采樣器。由于AGI-10液體沖擊式采樣器的采樣流量只有7升/min,發(fā)生低濃度氣溶膠時,采樣時間過長會對微生物具有較大損傷,AGI-10不適用于低濃度微生物氣溶膠采樣,應使用Anderson六級空氣微生物采樣器進行采樣檢測。發(fā)生高濃度粘質沙雷氏菌8039和噬菌體D29氣溶膠時,在暴露裝置的周圍放置沉降平板,沉降平板未見相應微生物的生長,結果表明在使用高濃度模擬微生物進行氣溶膠評價時未發(fā)生氣溶膠泄露。 本研究對噬菌體D29氣溶膠的特性參數進行了研究,并建立了噬菌體D29氣溶膠的QPCR檢測方法。建立了動物口鼻氣溶膠暴露技術平臺,模擬細菌、病毒氣溶膠分布均勻,各暴露口濃度差異不顯著。高濃度氣溶膠暴露時模擬微生物氣溶膠未發(fā)生泄露。對各種濃度的微生物氣溶膠采樣方法進行了研究,為下一步噬菌體D29氣溶膠吸入治療的動物實驗奠定了基礎。
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【學位授予單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2008
【分類號】：R52;R371

【引證文獻】

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1 陳芳;耐藥結核病治療用噬菌體干粉吸入劑的研究[D];廣西醫(yī)科大學;2012年

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本文編號：2458966