【摘要】： 1-磷酸鞘氨醇(sphingosine-1-phosphate, SIP)是一種存在于血漿中的多效信號(hào)脂質(zhì)分子。它既可在細(xì)胞內(nèi)作為第二信使傳遞信號(hào),同時(shí),它亦可作為第一信使與細(xì)胞膜上相應(yīng)的G蛋白偶聯(lián)受體相互作用參與包括細(xì)胞遷移、存活、增殖、血管生成、免疫以及過敏反應(yīng)等生物學(xué)作用。現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)與S1P特異性結(jié)合的G蛋白偶聯(lián)受體共有5種,分別為S1P1R、S1P2R、S1P3R、S1P4R和S1P5R(亦稱S1P1、S1P2、S1P3、S1P4和S1P5)。由于其基因序列與內(nèi)皮細(xì)胞相似,曾有一段時(shí)間被稱為內(nèi)皮細(xì)胞分化因子(EDG1、EDG5、EDG3、EDG6和EDG8)。經(jīng)過多年的研究,普遍認(rèn)同細(xì)胞種類的不同,S1P受體的表達(dá)情況也有很大的差異。大量研究證明內(nèi)皮細(xì)胞中只存在S1P1R、S1P3R和無／少量S1P2R,這三種受體的表達(dá)及激活狀態(tài)的動(dòng)態(tài)平衡維持正常內(nèi)皮細(xì)胞的功能。在內(nèi)皮細(xì)胞的一個(gè)重要功能——內(nèi)皮屏障功能中,S1P1R的激活能降低內(nèi)皮細(xì)胞通透性,從而增加內(nèi)皮屏障功能；S1P2R和S1P3R則相反,其激活能增加內(nèi)皮細(xì)胞通透性,從而降低內(nèi)皮屏障功能。在S1P受體生理學(xué)功能已研究較透徹的同時(shí),病理情況下對(duì)S1P受體表達(dá)及其功能影響的研究尚少。LPS及TNF-α作為致炎物質(zhì)能破壞內(nèi)皮細(xì)胞間連接,從而導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞通透性的增高。本研究選取ECV 304和HMVEC細(xì)胞,采用RT-PCR和Western blot方法,在明確ECV 304和HMVEC細(xì)胞S1P受體表達(dá)特性的基礎(chǔ)上,探討LPS或TNF-α刺激對(duì)這兩種細(xì)胞S1P受體表達(dá)的影響；并通過雙層小室檢測內(nèi)皮細(xì)胞單層熒光標(biāo)記物的漏出率,用通透系數(shù)Pa的大小反應(yīng)內(nèi)皮細(xì)胞單層的通透性,觀察其受體表達(dá)和活性的變化對(duì)LPS或TNF-α所致的內(nèi)皮細(xì)胞高通透性中的作用。 一、S1P受體在ECV 304和HMVEC中的特點(diǎn) 已有不少文獻(xiàn)報(bào)道,內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)的S1P受體主要是S1P1R、S1P2R和S1P3R。本實(shí)驗(yàn)證明了ECV 304及HMVEC細(xì)胞中均有S1P1R、S1P2R和S1P3RmRNA的表達(dá)。但在蛋白水平上,ECV 304細(xì)胞中僅可見S1P2R的蛋白條帶,而在HMVEC中,可見SIPIR、S1P2R和S1P3R的蛋白條帶。結(jié)果顯示：在ECV304細(xì)胞中較多表達(dá)S1P2R,而不表達(dá)S1P1R和S1P3R。在HMVEC中,S1P1R的表達(dá)較多,S1P3R的表達(dá)次之,而S1P2R表達(dá)較少。結(jié)果提示,雖然在mRNA水平上ECV 304和HMVEC的S1P受體表達(dá)沒有差別,但蛋白表達(dá)顯示明顯的特點(diǎn)。本結(jié)果進(jìn)一步證明,不同來源的內(nèi)皮細(xì)胞S1P受體的表達(dá)各有差異,體現(xiàn)了內(nèi)皮細(xì)胞的異質(zhì)性；研究還首次查明了ECV 304和HMVEC中S1P受體表達(dá)的特點(diǎn)。 二、LPS刺激后ECV 304和HMVEC細(xì)胞S1P受體表達(dá)的改變及其對(duì)通透性的影響 1.LPS刺激后ECV 304和HMVEC細(xì)胞S1P1R和S1P3R表達(dá)的改變 (1)LPS刺激后ECV 304細(xì)胞S1P1R和S1P3R表達(dá)的改變 LPS刺激后, ECV 304細(xì)胞S1P1R和S1P3R的mRNA表達(dá)變化無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05),亦未見明顯的蛋白表達(dá)。 (2)LPS刺激后HMVEC細(xì)胞S1P1R和S1P3R表達(dá)的改變 LPS刺激后,HMVEC的S1P1R和S1P3R的mRNA表達(dá)變化無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05),蛋白表達(dá)亦未見明顯變化。 2.LPS刺激后ECV 304和HMVEC細(xì)胞S1P2R表達(dá)的改變 (1)LPS刺激后ECV 304細(xì)胞S1P2R表達(dá)的改變 結(jié)果表明,LPS刺激可以分別以劑量和時(shí)間依賴的關(guān)系使ECV 304細(xì)胞S1P2R mRNA的表達(dá)較正常對(duì)照組顯著增加(P0.05)；蛋白表達(dá)結(jié)果也顯示,在ECV 304細(xì)胞中,LPS以劑量和時(shí)間依賴的方式使S1P2R蛋白的表達(dá)較正常對(duì)照組顯著增高(P0.01)。 結(jié)果提示,LPS刺激ECV 304細(xì)胞可使其S1P2R的mRNA和蛋白表達(dá)水平均顯著增加。 (2)LPS刺激后HMVEC細(xì)胞S1P2R表達(dá)的改變 結(jié)果表明,LPS刺激可以分別以劑量和時(shí)間依賴的關(guān)系使HMVEC細(xì)胞S1P2R mRNA的表達(dá)較正常對(duì)照組顯著增加(P0.05)；蛋白表達(dá)結(jié)果也顯示,在HMVEC細(xì)胞中,LPS以劑量和時(shí)間依賴的方式使S1P2R蛋白的表達(dá)較正常對(duì)照組顯著增高(P0.05)。 結(jié)果提示,LPS刺激HMVEC細(xì)胞可使其S1P2R的mRNA和蛋白表達(dá)水平均顯著增加。 3.抑制S1P2R的活性對(duì)LPS介導(dǎo)的ECV 304和HMVEC內(nèi)皮細(xì)胞高通透性的影響 (1)抑制S1P2R的活性對(duì)LPS介導(dǎo)的ECV 304內(nèi)皮細(xì)胞高通透性的影響 在ECV 304細(xì)胞中,0.2nmol/ml JTE-013使Pa值從單純LPS刺激的192%下降到134%(P=0.000)。結(jié)果提示,抑制S1P2R的活性后能有效降低LPS介導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞高通透性。 (2)抑制S1P2R的活性對(duì)LPS介導(dǎo)的HMVEC中內(nèi)皮細(xì)胞高通透性的影響 在HMVEC中,JTE-013 0.2nmol/ml使Pa值從單純LPS刺激的206%下降到156%(P=0.010)。結(jié)果提示,抑制S1P2R的活性后能有效降低LPS介導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞高通透性。 三、TNF-α刺激后ECV 304和HMVEC細(xì)胞S1P受體表達(dá)的改變及其對(duì)通透性的影響 1.TNF-α刺激后ECV 304和HMVEC細(xì)胞中S1P1R表達(dá)的改變 (1)TNF-α刺激后ECV 304細(xì)胞中S1P1R表達(dá)的改變 結(jié)果表明,TNF-α刺激可以分別以劑量和時(shí)間依賴的關(guān)系使ECV 304細(xì)胞S1P1R mRNA的表達(dá)較正常對(duì)照組顯著增加(P0.01)。結(jié)果提示,TNF-α刺激ECV 304細(xì)胞可使其S1P1R的mRNA表達(dá)水平顯著增加。 (2)TNF-α刺激后HMVEC細(xì)胞中S1P1R表達(dá)的改變 在HMVEC細(xì)胞中,100ng/ml的TNF-α刺激24 h后使S1P1R的表達(dá)較正常對(duì)照組顯著增加(P0.01),且刺激12 h和24 h后的變化也有顯著差異。之間有顯著差別(P0.05)。結(jié)果提示,TNF-α刺激HMVEC細(xì)胞可時(shí)間依賴地導(dǎo)致S1P1R的mRNA表達(dá)水平增加。 2.TNF-α刺激后ECV 304和HMVEC細(xì)胞中S1P2R表達(dá)的改變 (1)TNF-α刺激后ECV 304細(xì)胞中S1P2R表達(dá)的改變 TNF-α刺激可以分別以劑量和時(shí)間依賴的關(guān)系使ECV 304細(xì)胞S1P2RmRNA的表達(dá)較正常對(duì)照組顯著增加(P0.01);蛋白表達(dá)結(jié)果也顯示,在ECV304細(xì)胞中,TNF-α以劑量和時(shí)間依賴的方式使S1P2R蛋白的表達(dá)較正常對(duì)照組顯著增高(P0.05)。 結(jié)果提示,TNF-α刺激ECV 304細(xì)胞可使其S1P2R的mRNA和蛋白表達(dá)水平均顯著增加。 (2)TNF-α刺激后HMVEC細(xì)胞中S1P2R表達(dá)的改變＼ 結(jié)果表明,TNF-α刺激可以劑量依賴的關(guān)系使HMVEC細(xì)胞S1P2RmRNA的表達(dá)較正常對(duì)照組顯著增加(P0.05)；但在時(shí)間效應(yīng)中,TNF-α刺激12 h后S1P2RmRNA表達(dá)出現(xiàn)明顯的下調(diào)現(xiàn)象(P0.01),在24 h后S1P2RmRNA表達(dá)則顯著增加(P0.01)。蛋白表達(dá)結(jié)果也顯示,在HMVEC細(xì)胞中,TNF-α以劑量依賴的方式使S1P2R蛋白的表達(dá)較正常對(duì)照組顯著增高(P0.05)；而在時(shí)間效應(yīng)中,S1P2R蛋白表達(dá)在刺激24 h后出現(xiàn)顯著增加(P0.05)。 結(jié)果提示,TNF-α刺激HMVEC細(xì)胞可使其S1P2R的mRNA和蛋白表達(dá)水平均顯著增加。 3.TNF-α刺激后ECV 304和HMVEC細(xì)胞中S1P3R表達(dá)的變化 (1)TNF-α刺激后ECV 304細(xì)胞中S1P3R表達(dá)的變化 TNF-α刺激后,ECV 304的S1P3R的mRNA表達(dá)變化無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。 (2)TNF-α刺激后HMVEC細(xì)胞中S1P3R表達(dá)的變化 TNF-α刺激后,HMVEC的S1P3R的mRNA表達(dá)變化無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。 4.抑制S1P2R的活性對(duì)TNF-α介導(dǎo)的ECV 304和HMVEC內(nèi)皮細(xì)胞高通透性的影響 (1)抑制S1P2R的活性對(duì)TNF-α介導(dǎo)ECV 304內(nèi)皮細(xì)胞高血管通透性的作用 在ECV 304細(xì)胞中,0.2nmol/ml JTE-013使Pa值從單純TNF-α刺激的208%下降到156%(P=0.000)。結(jié)果提示,抑制S1P2R的活性后能有效降低TNF-α介導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞高通透性。 (2)抑制S1P2R的活性對(duì)TNF-α介導(dǎo)HMVEC內(nèi)皮細(xì)胞高血管通透性的作用 在HMVEC細(xì)胞中,0.2nmol/ml JTE-013使Pa值從單純TNF-α刺激的209%下降到153%(P=0.000)。結(jié)果提示,抑制S1P2R的活性后能有效降低TNF-α介導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞高通透性。 結(jié)論： 1.靜息ECV 304細(xì)胞表達(dá)S1P1R、S1P2R和S1P3RmRNA、S1P2R蛋白。而靜息HMVEC表達(dá)S1P1R、S1P2R和S1P3RmRNA和蛋白。 2.LPS刺激后ECV 304和HMVEC細(xì)胞S1P1R和S1P3R的mRNA及蛋白表達(dá)均無明顯變化,S1P2R的mRNA和蛋白表達(dá)水平顯著增高。結(jié)果提示S1P2R的表達(dá)增加可能參與介導(dǎo)LPS刺激對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的損傷。 3.TNF-α刺激后ECV 304和HMVEC中的S1P2R和蛋白表達(dá)顯著提高；TNF-α刺激也引起ECV 304和HMVEC細(xì)胞S1P1R mRNA的表達(dá)增高；而S1P3R的mRNA表達(dá)無明顯改變。結(jié)果提示S1P2R的表達(dá)增加可能參與介導(dǎo)TNF-α刺激對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的損傷。 4.抑制S1P2R的活性可降低LPS和TNF-α介導(dǎo)的單層細(xì)胞通透性增高,提示S1P2R的功能變化可能是LPS和TNF-α介導(dǎo)單層細(xì)胞通透性增高的途徑之一。
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【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號(hào)】：R363

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2456152