【摘要】： 未成熟樹突狀細胞分泌的exosomes延長大鼠小腸移植受體的存活時間 第一章大鼠小腸移植模型的建立 目的建立穩(wěn)定而可靠的大鼠異位節(jié)段性小腸移植模型。 方法近交系F344大鼠為供體,近交系Wistar大鼠為受體。取帶血管的10cm-15cm左右小腸段作為供腸,帶部分腹主動脈的腸系膜上動脈與受體腎下腹主動脈行端-側吻合,供體門靜脈與受體腎下下腔靜脈行端-側吻合。供腸近端結扎后固定于腹壁,遠端腸管右下腹壁造瘺。 結果共進行了56次正式實驗,在未用免疫抑制劑的情況下,50例受體存活時間超過3天,造模成功率為89.3%。供體平均手術時間(37.3±1.6)min,受體平均手術時間為(57.3±4.1)min,其中動脈吻合(10.4±1.6)min,靜脈吻合(8.9±0.7) min,移植小腸冷缺血時間(21.9±2.1) min,熱缺血時間(19.3±2.0) min。受體大鼠(陰性對照組)生存時間最短為5d,最長為8d,平均(7.0±0.6)d。 結論采用本方法建立的大鼠小腸移植模型穩(wěn)定、可靠、成功率高,為后續(xù)實驗打下了基礎。 第二章未成熟樹突狀細胞(imDC)分泌的exosomes制備與鑒定 目的探討體外誘導和擴增大鼠骨髓來源imDC,分離純化imDC分泌的exosomes(imDex)的方法,并從形態(tài)學、分子表型和免疫學功能等方面對imDex予以鑒定。 方法無菌條件下獲取大鼠骨髓前體細胞,在GM-CSF(5ng/ml)+IL-4(5ng/ml)條件下進行體外誘導、擴增,隔日半量換液,第6天收獲細胞。通過倒置顯微鏡及電鏡觀察細胞形態(tài),流式細胞儀檢測細胞表面分子表達情況,ELISA檢測細胞培養(yǎng)上清細胞因子含量,鑒定收獲的細胞是否為imDC。再此基礎上,收集培養(yǎng)6天的imDC細胞上清,超速離心法分離imDex,膜超濾離心法純化除菌。透射電鏡觀察imDex形態(tài),流式細胞儀檢測imDex膜表面分子表達情況,混合淋巴細胞反應(MLR)進行imDex功能學檢測。 結果培養(yǎng)至第6天可獲得imDC。電鏡下可見細小樹突狀突起,流式細胞儀檢測表明imDC低表達MHCII、CD80、CD86及CD40分子,ELISA檢測顯示imDC分泌促炎性細胞因子IL-12p70能力顯著低于成熟DC(mDC)。超速離心imDC細胞上清可分離獲得imDC分泌的imDex。膜超濾離心純化除菌后透射電鏡下觀察可見imDex為直徑介于50-100nm,具有典型脂質雙分子層結構的小囊泡。流式細胞儀檢測表明imDex高表達MHCII分子,低表達或不表達CD80、CD86及CD40分子。MLR檢測顯示imDex在imDC的輔助下刺激T淋巴細胞增殖的能力顯著低于成熟DC(mDC)分泌的exosomes(mDex)。 結論本法是體外制備大鼠骨髓來源imDC分泌的imDex的有效方法,為后續(xù)實驗打下了基礎。 第三章ImDC分泌的exosomes延長大鼠小腸移植受體的生存時間及相關機制 目的探討靜脈輸注供體imDex能否有效的延長大鼠小腸移植受體的存活時間,并進一步研究imDex誘導移植免疫耐受的可能機制。 方法供體為F344大鼠,受體為Wistar大鼠,供受體間進行異位節(jié)段性小腸移植。首先根據(jù)受體接受不同劑量供體來源的imDex處理將受體大鼠分為5組,A組(未處理組,n=6):移植前1周注射1ml生理鹽水;B組(n=6):移植前1周注射含供體1μg imDex混懸液1ml;C組(n=6):移植前1周注射含供體10μg imDex混懸液1ml;D組(n=6):移植前1周注射含供體20μg imDex的混懸液1ml;E(n=6)組:移植前1周注射含供體50μgimDex的混懸液1ml。通過對不同劑量的供體imDex延長受體大鼠生存時間的比較,篩選出最佳劑量。再根據(jù)最佳劑量,重復大鼠小腸移植實驗及分組:未處理組(n=6):移植前1周經(jīng)陰莖背靜脈注射1ml生理鹽水;最佳劑量組(n=6):移植前1周經(jīng)陰莖背靜脈注射含供體最佳劑量imDex混懸液1ml。移植術后當未處理組出現(xiàn)移植排斥的表現(xiàn)是,收取各組大鼠的外周血、脾臟及移植小腸分析。ELISA法檢測各組受體大鼠血清細胞因子IL-2、IFN-γ、TNF-α及TGF-β含量,混合淋巴細胞反應(MLR)檢測各組受體大鼠脾臟T淋巴細胞增殖能力,并ELISA法檢測MLR上清細胞因子IL-10及IFN-γ含量。流式細胞儀檢測各組受體大鼠脾臟T淋巴細胞中CD4+CD25+T細胞比例,實時定量PCR檢測各組受體大鼠脾臟T淋巴細胞Foxp3mRNA表達。常規(guī)病理切片(HE染色)觀察各組移植小腸病理變化。 結果A、B、C、D及E組受體平均存活時間分別為(7.0±0.6)天、(7.3±1.0)天,(9.8±1.2)天,(14.5±1.0)天和(7.8±1.2)。C組(10μgimDex)較A組(未處理組)受體存活時間輕度升高,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05), D組(20μgimDex)受體存活時間顯著高于C組(P0.05),B組(1μgimDex)及E組(50μgimDex)受體存活時間較A組差異無統(tǒng)計學意義(P0.05)。ELISA檢測顯示imDex(20μg)治療組血清促炎性細胞因子IL-2、IFN-γ及TNF-α較未處理組顯著降低,而抑炎性細胞因子TGF-β含量則顯著升高。MLR結果顯示imDex(20μg)治療組受體大鼠脾臟T淋巴細胞在同種異體抗原的刺激下增殖受到顯著抑制,促炎性細胞因子IFN-γ分泌較未處理組顯著降低,而抑炎性細胞因子IL-10分泌顯著升高。流式細胞儀及實時定量PCR檢測imDex(20μg)治療組脾臟CD4+CD25+T細胞比例及Foxp3mRNA表達較未處理組顯著升高。移植后第7天陰性對照組病理為急性重度排斥反應的表現(xiàn),造瘺口壞死,閉塞,而imDex(20μg)治療組為輕度排斥反應的表現(xiàn),造瘺口粘膜紅潤,輕度水腫,分泌少許腸液。 結論ImDC分泌的imDex可抑制大鼠小腸移植后的急性排斥反應,降低了受體血清促炎性細胞因子的變化,延長了受體存活時間。受體脾臟CD4+CD25+Foxp3+調節(jié)性T細胞比例升高,進而抑制受體初始T淋巴細胞增殖可能是imDex誘導移植免疫耐受的機制之一。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：南京醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2010
【分類號】：R392

【參考文獻】

相關期刊論文 前8條

1 周慧江;尹路;;小腸移植后急性排斥反應的新進展[J];外科理論與實踐;2006年04期

2 李元新,黎介壽,李寧;大鼠小腸移植的外科技術[J];華人消化雜志;1998年08期

3 劉袁媛;范華驊;任亞娜;楊潔;聶曉絢;趙麗華;林俊杰;;小鼠調節(jié)性樹突狀細胞分泌的外泌體誘導免疫耐受的實驗研究[J];中國實驗血液學雜志;2008年02期

4 肇毅,陸森,沈歷宗,華一兵,吳文溪;大鼠小腸移植模型的建立與改進[J];江蘇醫(yī)藥;2004年03期

5 李寧;小腸移植的進展[J];中國實用外科雜志;2004年01期

6 魏明發(fā)，，王果，夏谷良，方素飛，汪麗珠;大鼠小腸移植實驗研究中幾個問題的處理[J];中華小兒外科雜志;1994年01期

7 李為民;劉巍;高成;周保國;王政;張瑞宏;孔一慧;李悅;韓薇;甘潤韜;薛洪杰;耿建強;楊樹森;邵群;張美;;白細胞介素-10基因修飾的未成熟樹突狀細胞誘導自身免疫性心肌炎特異性耐受的實驗研究[J];中華心血管病雜志;2006年08期

8 顧曉,楊尚琪,唐孝達,劉永,周佩軍;大鼠異位心臟移植術圍手術期并發(fā)癥的原因及預防[J];中國胸心血管外科臨床雜志;2000年04期

本文編號：2452571