【摘要】： 第一部分鈣敏感受體在肺動(dòng)脈血管平滑肌上表達(dá)及功能 目的：(1)探討鈣敏感受體在肺動(dòng)脈平滑肌組織與細(xì)胞上的表達(dá)、分布。(2)探討鈣敏感受體在高鈣誘導(dǎo)肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞胞漿鈣離子濃度變化中的作用。 方法：用組織貼塊法原代培養(yǎng)大鼠肺動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞，用胰蛋白酶消化法進(jìn)行細(xì)胞傳代培養(yǎng)。用鈣敏感受體特異性單克隆抗體，，采用免疫印跡、組織與細(xì)胞化學(xué)免疫熒光技術(shù)檢測(cè)鈣敏感受體在大鼠肺動(dòng)脈血管平滑肌組織與細(xì)胞上的表達(dá)與分布。采用鈣熒光探針Fura-2／AM和顯微熒光成像系統(tǒng)檢測(cè)胞漿鈣離子濃度。 結(jié)果：(1)細(xì)胞的形態(tài)與平滑肌肌動(dòng)蛋白α的特異性表達(dá)證實(shí)所培養(yǎng)的細(xì)胞為大鼠肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞。(2)特異性抗體檢測(cè)發(fā)現(xiàn)肺動(dòng)脈血管平滑肌組織和細(xì)胞均有鈣敏感受體的表達(dá)，細(xì)胞膜與細(xì)胞漿均見其分布，且分子量不同，分別為55-72kD和170kD左右。(3)6 mM和7.5 mM[Ca~(2+)]_0分別使肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞胞漿鈣離子濃度從76.53±2.23 nM快速上升至238.78±7.26和382.74±9.87 nM(p＜0.01，N=23)，并維持在高位水平，形成一高平臺(tái)，細(xì)胞外液恢復(fù)到常鈣時(shí)，胞漿鈣離子濃度先迅速下降，然后緩慢下降，并形成一略高于基線的平臺(tái)；而4 mM[Ca~(2+)]_0引起胞漿鈣離子濃度的變化與基線水平無(wú)顯著差異(p＞0.05，N=23)。(4)鈣敏感受體抑制劑Calhex 231 1μM+6 mM或7.5 mM[Ca~(2+)]_0使肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞胞漿鈣離子濃度從75.54±6.48 nM分別上升至139.26±11.25 nM和198.89±18.39 nM(p＜0.01，N=21)；3μM Calhex 231+6mM或7.5 mM Ca~(2+)使胞漿鈣離子濃度從77.91±3.65 nM上升至99.15±6.18 nM和119.07±10.63 nM(p＜0.01，N=20)；而0.1μM Calhex 231對(duì)6 mM和7.5 mM[Ca~(2+)]_0所致鈣離子濃度變化無(wú)顯著影響(p＞0.05，N=23)。 結(jié)論：(1)肺動(dòng)脈血管平滑肌組織與細(xì)胞均有對(duì)胞外鈣敏感的受體，細(xì)胞膜與細(xì)胞漿均見其分布。(2)鈣敏感受體抑制劑Calhex 231顯著抑制胞外高鈣所致肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞胞漿鈣離子濃度的升高，表明鈣敏感受體參與了細(xì)胞外高鈣引起肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞胞漿鈣離子濃度的升高。 第二部分新的細(xì)胞外鈣感受機(jī)制在缺氧引起肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞胞漿鈣離子濃度變化中的作用 目的：(1)證實(shí)缺氧對(duì)肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞胞漿鈣離子濃度及活性氧的變化。(2)探討鈣敏感受體在缺氧觸發(fā)肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞鈣信號(hào)變化中的作用。(3)確定缺氧時(shí)肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞活性氧變化與鈣敏感受體活化，胞漿鈣離子濃度變化之間的關(guān)系。 方法：向灌流液中充入氮?dú)鈴?fù)制細(xì)胞缺氧模型，采用鈣熒光探針Fura-2／AM、活性氧敏感探針H_2-DCFDA和顯微熒光成像系統(tǒng)檢測(cè)胞漿鈣離子濃度及活性氧含量的變化。運(yùn)用RNAi技術(shù)特異性抑制CaR基因的表達(dá)，采用免疫印跡技術(shù)檢測(cè)干擾效率。 結(jié)果：(1)肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞經(jīng)三次間斷的低氧處理，胞漿鈣離子濃度從77.66±1.74 nM分別上升到161.13±11.25 nM、133.03±8.44 nM、109.94±4.64 nM，均顯著高于基線水平(p＜0.01，N=51)，且后一次缺氧產(chǎn)生的鈣離子濃度峰值均明顯小于前一次(p＜0.01)。(2)用低氧無(wú)鈣液灌流肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞，胞漿鈣離子濃度下降至69.65±3.59 nM，略低于基線水平(78.09±2 nM，N=43)，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p＞0.05)，但與有胞外鈣的單純?nèi)毖踅M(133.03±8.44 nM，N=51)相比，顯著降低(p＜0.01)。(3)實(shí)驗(yàn)分為Blankcontrol、ShRNA control和ShRNA targeted三組，其[Ca~(2+)]_i基線水平分別為80.67±3.49nM(N=14)、79.3±4.17 nM(N=11)和80.53±4.3 nM(N=9)，各組之間無(wú)顯著差異(p＞0.05)。缺氧使ShRNA targeted組肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞[Ca~(2+)]_i上升至109.16±8.41 nM，比Blank control組(148.22±8.89 nM)和ShRNA control組(150.68±10.48 nM)顯著降低(p＜0.01)。100μM組胺刺激Blank control、ShRNA control及ShRNA targeted組肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞，使[Ca~(2+)]_i分別上升為222.21±15.33 nM、223.12±16.85 nM、224.48±18.76nM，各組之間無(wú)顯著差異(p＞0.05)。(4)缺氧(PO_2為14.3±2.5 mmHg)使肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞內(nèi)活性氧熒光絕對(duì)值從824.44±26.43上升到2590.66±97.37，平均升高至常氧的3.14±0.13倍(p＜0.01，N=22)，活性氧熒光值變化率[(處理后熒光值-處理前熒光值)／處理前熒光值×100％]為(214.23±10.58)％。(5)細(xì)胞外分別加入0.1、1、10、20、30、50和100μM H_2O_2模擬缺氧所致肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞活性氧的變化，得到一回歸曲線：y=0.064x+1.9023，R~2=0.9897[其中x為活性氧熒光值變化率(％)，y為過氧化氫濃度(μM)]，并計(jì)算出上述缺氧模型所致肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞活性氧濃度為(15.61±1.24)μM(N=22)。(6)用15.61μM H_2O_2處理Blank control、ShRNA control和ShRNA targeted三組肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞3分鐘，其[Ca~(2+)]_i分別上升至151.27±9.7nM(N=12)、149.83±10.05 nM(N=8)、105.7±7.83 nM(N=7)，其中ShRNA targeted組比Blank control和ShRNA control顯著降低(p＜0.01)。各組之間基線[Ca~(2+)]_i及100μM組胺所致的[Ca~(2+)]_i峰值無(wú)顯著差異(p＞0.05)。 結(jié)論：缺氧通過增加活性氧來活化CaR使其敏感性增高，在細(xì)胞外常鈣作用下被激活，引起肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞胞漿鈣離子濃度升高。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2009
【分類號(hào)】：R363

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 胡清華，王迪潯;肺、腦動(dòng)脈內(nèi)皮和平滑肌細(xì)胞急性缺氧時(shí)某些第二信使的變化[J];中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院學(xué)報(bào);1998年01期

本文編號(hào)：2452083