【摘要】： 胚胎干細胞具有自我更新及多向分化潛能,為發(fā)育學、遺傳學、人類疾病的發(fā)病機理與替代治療等研究提供非常寶貴的資源。由于其應用價值,科學家們曾嘗試通過不同途徑實現體細胞重編程以獲取ES細胞或ES細胞樣的細胞或多潛能干細胞(Induced pluripotentstem cells,iPS cells),這些途徑主要包括體細胞核移植、體細胞與多潛能細胞融合后的重編程、將分化的體細胞在卵細胞或多潛能干細胞的抽提物中孵育以實現體細胞重編程、體細胞經特定因子誘導重編程為iPS細胞。雖然運用前三種方法可以獲得多潛能干細胞,但是這些方法的廣泛應用在技術、細胞來源、免疫排斥、倫理、宗教和法律等方面存在諸多限制,而iPS細胞不受這些問題的限制,且制備簡單易行;相對體細胞核移植技術而言,iPS細胞技術為體細胞和腫瘤細胞重編程機制研究提供了理想而簡便的體外研究體系,正因為iPS細胞技術的獨特優(yōu)勢,以前采用體細胞核移植技術研究體細胞和腫瘤細胞重編程機制的科學家紛紛放棄該技術,轉而采用iPS細胞技術。 鑒于此,本試驗擬借助慢病毒載體法將Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc四種基因導入小鼠胚胎成纖維細胞(MEFs),進而將其重編程為iPS細胞,以實現下列目標:(1)熟練掌握基于慢病毒載體法將體細胞重編程為iPS細胞的技術,以為下一步利用iPS細胞技術研究腫瘤細胞重編程機制提供技術保障;(2)建立小鼠iPS細胞系,以為后續(xù)研究[如iPS細胞生物學特性和行為(如自我復制、增殖和分化等)調控機制研究)奠定基礎。 目的: 借助慢病毒載體法將Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc四種基因導入小鼠胚胎成纖維細胞(MEFs),進而將其重編程為iPS細胞,以實現多種目的(見上)。 方法: 1慢病毒載體pHAGE2-EF1α-STEMMCA及pHAGE2-EF1aFull-ZsGreen-W的鑒定 酶切鑒定分別使用EcoRⅠ、KpnⅠ和EcoRⅠ、XhoⅠ對pHAGE2-EF1α-STEMMCA進行酶切,分別使用EcoRⅠ、PvuⅡ和BamHⅠ、XhoⅠ對pHAGE2-EF1aFull-ZsGreen-W進行酶切;酶切產物進行0.6%瓊脂糖凝膠電泳。 PCR鑒定根據Oct4、Klf4、c-Myc和Sox2序列設計引物分別擴增Oct4、Klf4、c-Myc和Sox2基因;PCR擴增后,取5μl反應液進行1%瓊脂糖凝膠電泳。 2慢病毒生產與成功生產鑒定 慢病毒包裝與濃縮按標準程序進行慢病毒包裝(脂質體介導的瞬時轉染)、超速離心濃縮和保存等。 慢病毒成功生產的鑒定用病毒上清或濃縮后的病毒感染293FT細胞,24～48h后熒光顯微鏡下觀察是否見綠色熒光。 3利用細胞模型在體外驗證EGFP能否正常表達 用病毒上清感染MEFs,24～48h后熒光顯微鏡下觀察是否見綠色熒光。 4慢病毒載體法重編程MEFs為iPS細胞 用濃縮病毒感染攜帶有Pou5f1-EGFP基因的MEFs,12h后棄病毒感染液,更換為鼠ES細胞培基,之后每天更換培基直到第二十天克隆足夠大時挑克隆擴大培養(yǎng)。 5鼠iPS細胞建系及其生物學特性鑒定 1) iPS細胞克隆上綠色熒光蛋白基因表達情況 2)所有iPS細胞系傳代培養(yǎng)至第5代后,進行AKP染色鑒定; 3)提取iPS細胞總RNA,并進而通過RT-PCR檢測鼠ES細胞標志性基因表達; 4)懸浮培養(yǎng)觀察擬胚體形成及分化情況; 5) iPS細胞接種至SCID小鼠皮下,觀察畸胎瘤形成情況。 結果: 1慢病毒載體pHAGE2-EF1α-STEMMCA及pHAGE2-EF1aFull-ZsGreen-W鑒定 酶切鑒定pHAGE2-EF1α-STEMMCA及pHAGE2-EF1aFull-ZsGreen-W經EcoRⅠ單酶切,酶切產物經0.6%瓊脂糖凝膠電泳均可見一條預期大小的條帶;pHAGE2-EF1α-STEMMCA經KpnⅠ單酶切和EcoRⅠ、XhoⅠ雙酶切酶切產物經0.6%瓊脂糖凝膠電泳均可見兩條預期大小的條帶;pHAGE2-EF1aFull-ZsGreen-W經PvuⅡ單酶切和BamHⅠ、XhoⅠ雙酶切,酶切產物經0.6%瓊脂糖凝膠電泳均可見兩條預期大小的條帶。 PCR鑒定以質粒pHAGE2-EF1α-STEMMCA為模板,分別擴增Oct4、Klf4、c-Myc和Sox2基因,PCR產物大小均與預期值相符。 2慢病毒包裝、濃縮及鑒定 攜帶EGFP基因慢病毒的生產與鑒定將pHAGE2-EFlaFull-ZsGreen-W與病毒包裝質粒共轉染293FT細胞,48h后倒置熒光顯微鏡下可見綠色熒光,預示轉染成功。用收集的病毒上清感染293FT細胞,48h后倒置熒光顯微鏡下可觀察到綠色熒光,這進一步說明病毒已成功生產;同時也表明EGFP轉基因能夠正常表達。 攜帶Oct4、Klf4、c-Myc和Sox2基因的慢病毒生產與鑒定將pHAGE2-EF1α-STEMMCA與病毒包裝質粒共轉染293FT細胞,48h后倒置熒光顯微鏡下可見合包體和細胞融合現象,預示病毒正在生產。 3利用細胞模型在體外驗證EGFP能否正常表達 用攜帶EGFP基因的慢病毒感染MEFs,48h后在倒置熒光顯微鏡下觀察到綠色熒光,這表明轉基因EGFP在MEFs內能夠正常表達。 4慢病毒載體法重編程MEFs為iPS細胞 病毒感染后第4天可見到ES克隆出現,第20天克隆足夠大可以挑克隆以擴大培養(yǎng),預示著MEFs已開始重編程。 5.iPS細胞生物學特性鑒定 1)第9天可見到有綠色熒光的iPS細胞克隆出現; 2) 4株iPS細胞系均具有典型的ES細胞克隆形態(tài),AKP染色呈強陽性; 3) 4株iPS細胞系均表達ES細胞特有的標志性基因; 4) 4株iPS細胞系均具有體外分化形成囊性擬胚體的能力,且可以分化為心肌細胞; 5) 4株iPS細胞系均能形成畸胎瘤。 結論: 1.運用Oct4、Klf4、c-Myc和Sox2四種基因成功將MEFs重編程為iPS細胞。 2.4株iPS細胞系均具有鼠ES細胞的一些生物學特,且在體外長期傳代中能夠維持此特性,初步證明建立了小鼠iPS細胞系。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：中南大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2009
【分類號】：R329

【相似文獻】

相關期刊論文 前10條

1 沈干,吳春芳,叢笑倩,劉曉音,劉偉,曹誼林;胚胎干細胞在轉化生長因子-β1誘導下表達vWF、CD34的研究[J];中華實驗外科雜志;2003年01期

2 劉鴻禧;胚胎干細胞的研究及其在臨床上的應用[J];汕頭大學醫(yī)學院學報;2003年01期

3 于增國,倫永志;胚胎干細胞與神經系統(tǒng)疾病的治療[J];大連大學學報;2003年06期

4 丁國治;;可轉變成多神細胞和組織的成人干細胞[J];國外醫(yī)學情報;2003年06期

5 周毅,宋純,呂冰潔,宋一民,許評,宋春芳;小鼠胚胎干細胞轉基因治療甲狀旁腺功能低下癥的實驗研究[J];中華實驗外科雜志;2004年02期

6 王波,黃荷鳳;胚胎干細胞向胰島細胞誘導分化的研究[J];國外醫(yī)學.生物醫(yī)學工程分冊;2004年02期

7 傅玉如,陳s，

本文編號：2450757