發(fā)布時間：2019-03-19 14:37

【摘要】：目的 研究外部引導序列(External Guide Sequences,EGS)對人巨細胞病毒(Human Cytomegalovirus, HCMV)臨床病毒株UL148基因表達的抑制作用,為探討UL148基因功能奠定基礎,為抗HCMV治療尋找新的治療途徑。 方法 細胞外實驗:1.根據(jù)靶基因UL148序列特征設計并合成DNA性質EGS;2.從HCMV臨床病毒株基因組中擴增UL148基因,克隆入pGEM-T-EASY質粒, PCR擴增UL148小片段,制備底物轉錄模板,參入32P-UTP后體外轉錄;3.從大腸桿菌DH5α基因組擴增M1RNA基因,將其克隆入pUC18質粒,線性化后,體外合成M1RNA;4.將底物UL148 RNA、EGS、M1RNA混合于切割反應液,37℃反應1h,以聚丙烯酰胺凝膠分離產(chǎn)物,應用Typhoons掃描儀分析切割結果。 細胞內(nèi)實驗:將UL148基因克隆入pEGFP-N1質粒,重組質粒轉染HeLa細胞,同時以pEGFP-N1質粒轉染HeLa細胞作為陰性對照,均以1mg/mL G418篩選4周。選取細胞外實驗證實有切割作用的EGS4,分別以50nM、100nM、200nM、400nM終濃度轉染G418篩選后的細胞。應用熒光顯微鏡觀察上述細胞熒光量的變化;應用熒光定量PCR進行絕對定量,分析EGS4對UL148表達量的沉默效果。 結果 細胞外實驗:1.共設計5條EGS;2.成功構建pT148重組質粒,PCR后擴增獲得UL148小片段轉錄模板,經(jīng)體外轉錄獲得32P標記的UL148小片段RNA;3.成功構建pUC-M1重組質粒,線性化后,體外轉錄合成M1RNA;4.在細胞外進行切割實驗,篩選出多條具有特異性切割UL148 RNA的EGS。 細胞內(nèi)實驗:成功構建p148-EGFP重組質粒;重組質粒p148-EGFP及pEGFP-N1質粒分別轉染HeLa細胞,經(jīng)G418篩選后,成功構建穩(wěn)定表達UL148基因的HeLa細胞系(UL148-HeLa)和穩(wěn)定表達EGFP的HeLa細胞系(EGFP-HeLa)。熒光顯微鏡觀察50nM、100nM、200nM、400nM的EGS4作用后,UL148-HeLa細胞的熒光量明顯減少,而EGFP-HeLa細胞熒光量無明顯改變。熒光定量PCR分析顯示50nM、100nM、200nM、400nM EGS4對UL148的抑制效率分別為74.9 %(P0.05)、78.6%(P0.05)、81.1%(P0.05)、87.0%(P0.05)。 結論 1.經(jīng)細胞外實驗篩選出2條具有特異性切割UL148 RNA作用的EGS,分別為EGS1和EGS4; 2.在細胞內(nèi)EGS4能有效沉默HCMV UL148基因的表達,并隨濃度的增加,沉默效果逐漸明顯; 3.細胞外EGS切割實驗系統(tǒng)可作為細胞內(nèi)切割實驗前的一種有效篩選途徑; 4.經(jīng)細胞外和細胞內(nèi)切割實驗篩選出的有效EGS,可用于研究UL148的基因功能,并且有望發(fā)展成為抗HCMV的小分子核酸藥物。
[Abstract]:Aim to study the inhibitory effect of (External Guide Sequences,EGS on the expression of UL148 gene in human cytomegalovirus (Human Cytomegalovirus, HCMV) clinical strain, to lay a foundation for exploring the function of UL148 gene and to find a new therapeutic way for anti-HCMV therapy. Methods: 1. Design and Synthesis of DNA EGS;2. based on the characteristics of UL148 sequence of Target Gene The UL148 gene was amplified from the genome of HCMV clinical virus strain, cloned into pGEM-T-EASY plasmid, UL148 small fragment was amplified by PCR, substrate transcription template was prepared and transcribed in vitro after incorporation into 32P-UTP. M1RNA gene was amplified from Escherichia coli DH5 偽 genome and cloned into pUC18 plasmid. After linearization, M1RNA4 was synthesized in vitro. The substrate UL148 RNA,EGS,M1RNA was mixed in the cutting solution and reacted at 37 鈩，

本文編號：2443617