【摘要】： 背景 缺血再灌注損傷是引起胸主動脈及脊柱手術(shù)后發(fā)生截癱的最主要原因。隨著大量新技術(shù)的應(yīng)用,此類手術(shù)術(shù)后并發(fā)癥已經(jīng)大大降低,但是近期的一項統(tǒng)計結(jié)果顯示,其發(fā)病率仍然超過了10%。因此如何預(yù)防胸主動脈及脊柱手術(shù)后的缺血再灌注損傷,仍然是個值得關(guān)注的課題。遠程缺血預(yù)處理是指,在耐受缺血能力較強的器官誘導(dǎo)短暫缺血,使得重要臟器產(chǎn)生缺血耐受的預(yù)處理方式,多選擇肢體作為誘導(dǎo)器官。由于其安全,容易被患者和醫(yī)生所接受,因此其臨床應(yīng)用前景巨大。近來研究表明,內(nèi)源性大麻素在中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷方面扮演著重要角色,并且參與了缺血預(yù)處理的發(fā)生機制。泛素系統(tǒng)功能異常是導(dǎo)致神經(jīng)元延遲死亡的重要原因。脊髓缺血損傷后泛素早期的持續(xù)表達增加,被證實與脊髓運動神經(jīng)元缺血易感性相關(guān)。本研究旨在探討遠程缺血預(yù)處理對脊髓缺血損傷的保護作用及其機制,為遠程缺血預(yù)處理直接應(yīng)用于臨床提供理論基礎(chǔ)。 實驗一肢體遠程缺血預(yù)處理在誘導(dǎo)大鼠脊髓缺血耐受中的作用 目的探討肢體遠程缺血預(yù)處理在誘導(dǎo)大鼠脊髓缺血耐受中的作用,為進一步機理研究奠定基礎(chǔ)。方法采用Fogarty導(dǎo)管阻斷胸主動脈血流合并系統(tǒng)低血壓(放血)的方法,制作大鼠脊髓缺血模型。暴露右側(cè)股動脈,在股動脈分叉以上處阻斷/開放,進行肢體遠程缺血預(yù)處理。雄性SD大鼠40只(300~350g),隨機分為5組(n=8):假手術(shù)組,大鼠接受和其它組動物一樣的手術(shù)操作包括置管及麻醉,但不誘導(dǎo)脊髓缺血及遠程缺血預(yù)處理;單純?nèi)毖獙φ战M,1~2%異氟醚麻醉60min,暴露右側(cè)股動脈,誘導(dǎo)脊髓缺血12min;遠程缺血預(yù)處理2min組,暴露右側(cè)股動脈,阻斷/開放(預(yù)處理)3個循環(huán),每次為2min阻斷/2min開放,遠程缺血預(yù)處理30min后,誘導(dǎo)脊髓缺血12min;遠程缺血預(yù)處理3min組,暴露右側(cè)股動脈,在股動脈分叉以上處阻斷/開放(預(yù)處理)3個循環(huán),每次為3min阻斷/3min開放,遠程缺血預(yù)處理30min后,誘導(dǎo)脊髓缺血12min。遠程缺血預(yù)處理5min組,暴露右側(cè)股動脈,在股動脈分叉以上處阻斷/開放(預(yù)處理)3個循環(huán),每次為5min阻斷/5min開放,遠程缺血預(yù)處理30min后,誘導(dǎo)脊髓缺血12min。再灌注24h、48h,由一不了解分組情況的觀察者,評估并記錄運動缺陷評分。評分方法:a)后肢行走:0分正常;1分行走時腳趾在肢體下伸展;2分趾關(guān)節(jié)行走;3分靠后肢挪動身體,但是無下肢行走;4分無行走并且后肢無運動。b)放置/踱步反射:0分正常;1分反應(yīng)弱;2分無踱步反射。每只動物的運動缺陷評分(MDI)為得分a+b�？偡�6分表示完全癱瘓,0分為功能正常。評分完畢后,截取腰段脊髓組織(L4～L6),行HE染色。光鏡下觀察HE染色結(jié)果并對脊髓前角正常神經(jīng)元計數(shù)。結(jié)果1.生理學(xué)參數(shù):脊髓缺血模型制作過程中缺血組間血流動力學(xué)指標(biāo)(PMAP、DMAP、HR),直腸溫度,pH、PaO2、PCO2及血糖變化在各組間均無明顯差異。脊髓缺血期間,各組遠端平均動脈壓力(DMAP)均維持在DMAP5mmHg,證實導(dǎo)管阻斷合并系統(tǒng)低血壓的方法制作大鼠的脊髓缺血模型阻斷確實,缺血效果可靠。缺血組近端動脈壓(PMAP),在脊髓缺血1min內(nèi)均由90mmHg降至45mmHg,表明各缺血組在系統(tǒng)低血壓的產(chǎn)生時間及水平上保持一致。4個缺血組大鼠,在脊髓缺血期間,都表現(xiàn)為心率下降,低于缺血前,有統(tǒng)計學(xué)差異,但是組間沒有差異。再灌注后5分鐘之內(nèi),HR、血壓,都可以恢復(fù)到缺血前水平,且缺血組間沒有差別。缺血組再灌注后血糖高于缺血前(p0.05),pH低于缺血前(p0.05),整個手術(shù)中未出現(xiàn)低氧及二氧化碳潴留。手術(shù)過程中,直腸溫度維持在37.2°C～37.5°C之間。各組動物體重,放血量沒有差異。假手術(shù)組動物各項生理學(xué)參數(shù)在整個手術(shù)操作過程中保持穩(wěn)定。2.運動缺陷評分(MDI):再灌注24h、48h,分別對所有動物進行運動缺陷評分。假手術(shù)組沒有神經(jīng)功能改變。預(yù)處理3min3個循環(huán)組,MDI低于對照組及其它兩組(P 0.01),表明運動功能好于其它3組。單純?nèi)毖獙φ战M、預(yù)處理2min組、預(yù)處理5min組MDI沒有統(tǒng)計學(xué)差異。3.前角正常神經(jīng)元計數(shù):在假手術(shù)組,未見損傷神經(jīng)元。預(yù)處理3min3個循環(huán)組,前角正常神經(jīng)元數(shù)量多于其它三個缺血組,包括對照組、預(yù)處理2min組及預(yù)處理5min組(P0.01)。對照組、預(yù)處理2min組及預(yù)處理5min組之間,前角正常神經(jīng)元計數(shù)無統(tǒng)計學(xué)差異。結(jié)論短暫下肢遠程缺血預(yù)處理可以誘導(dǎo)大鼠脊髓的缺血耐受。 實驗二大麻素受體在遠程缺血預(yù)處理誘導(dǎo)大鼠脊髓缺血耐受中的作用機理研究 目的探討大麻素受體拮抗劑對遠程缺血預(yù)處理誘導(dǎo)脊髓缺血耐受的影響,初步證明內(nèi)源性大麻素在遠程缺血預(yù)處理誘導(dǎo)大鼠脊髓缺血耐受的作用機制。方法雄性SD大鼠64只,隨機分為8組(n=8)。預(yù)處理方案為: 3個循環(huán),每次為3min阻斷/3min開放(預(yù)處理方案根據(jù)實驗一的結(jié)果制定)。分組:①單純?nèi)毖獙φ战M;②遠程缺血預(yù)處理組;③遠程缺血預(yù)處理+AM251組,每次預(yù)處理15min前靜脈注射大麻素受體(1CB1)拮抗劑AM251(1mg/kg體重);④遠程缺血預(yù)處理+AM630組,每次預(yù)處理15min前靜脈注射大麻素受體2(CB2)拮抗劑AM630(1mg/kg體重);⑤遠程缺血預(yù)處理+溶劑組;⑥AM251組,每次麻醉前15min靜脈注射AM251(1mg/kg體重);⑦AM630組:每次麻醉前15min靜脈注射AM630(1mg/kg體重);⑧溶劑組:每次麻醉前15min靜脈注射大麻素受體拮抗劑溶劑(1ml/kg體重)。所有組動物均接受脊髓缺血損傷,其方法如前所述。再灌注24h、48h,由一不了解分組情況的觀察者,評估并記錄運動缺陷評分。評分完畢后,截取腰段脊髓組織(L4～L6),行HE染色。光鏡下觀察HE染色結(jié)果并對脊髓前角正常神經(jīng)元計數(shù)。結(jié)果1.生理學(xué)參數(shù):各組未見差異。2.運動缺陷評分(MDI)遠程缺血預(yù)處理組MDI低于單純?nèi)毖獙φ战M,遠程缺血預(yù)處理+AM251組,(P0.05)。遠程缺血預(yù)處理組與RIPC+AM630組,及遠程缺血預(yù)處理+Vehicle組,MDI無差別。單純?nèi)毖獙φ战M,遠程缺血預(yù)處理+AM251組,AM251組,AM630組,Vehicle組之間沒有統(tǒng)計學(xué)差異。3.前角正常神經(jīng)元計數(shù):遠程缺血預(yù)處理組前角正常神經(jīng)元數(shù)量多于單純?nèi)毖獙φ战M和預(yù)處理+AM251組(P0.05)。遠程缺血預(yù)處理組與遠程缺血預(yù)處理+AM630組,及遠程缺血預(yù)處理+Vehicle組前角正常神經(jīng)元計數(shù)無差別。單純?nèi)毖獙φ战M,遠程缺血預(yù)處理+AM251組,AM251組,AM630組,溶劑組之間前角正常神經(jīng)元計數(shù)沒有統(tǒng)計學(xué)差異。結(jié)論CB1受體拮抗劑逆轉(zhuǎn)了遠程缺血預(yù)處理誘導(dǎo)的脊髓缺血耐受,表明CB1受體介導(dǎo)了遠程缺血預(yù)處理誘導(dǎo)脊髓缺血耐受的機制。 實驗三遠程缺血預(yù)處理誘導(dǎo)脊髓缺血耐受過程中內(nèi)源性大麻素含量的變化 目的探討遠程缺血預(yù)處理誘導(dǎo)脊髓缺血耐受過程中內(nèi)源性大麻素含量的變化。方法雄性SD大鼠24只,隨機分為2組(n=12):①缺血對照組。②預(yù)處理組。在缺血前即刻,以及缺血再灌注后1h兩個時間點,截取腰段脊髓組織(L4～L6),每個時間點取動物數(shù)量為6只。提取內(nèi)源性大麻素并利用液相質(zhì)譜儀(HPLC/MS)檢測內(nèi)源性大麻素AEA和2-AG的含量。結(jié)果1.生理學(xué)參數(shù):生理學(xué)參數(shù)各組未見差異。2.腰段脊髓AEA和2-AG的含量變化:缺血前,遠程缺血預(yù)處理組脊髓節(jié)段內(nèi)AEA含量要高于缺血對照組(p0.05)。缺血后兩組間AEA含量并未見統(tǒng)計學(xué)差異。單純?nèi)毖獙φ战M,缺血后AEA含量高于缺血前(p0.05)。兩組2-AG的濃度則在缺血前和缺血后均未見明顯變化。結(jié)論遠程缺血預(yù)處理可以誘導(dǎo)脊髓節(jié)段內(nèi)內(nèi)源性大麻素AEA在脊髓缺血前釋放增加,起到誘導(dǎo)脊髓缺血耐受的作用。 實驗四遠程缺血預(yù)處理對大鼠脊髓缺血后泛素化的調(diào)節(jié)及內(nèi)源性大麻素的作用 目的探討遠程缺血預(yù)處理對大鼠脊髓缺血后泛素化的調(diào)節(jié)及內(nèi)源性大麻素在此過程中的作用。方法雄性SD大鼠24只,隨機分為3組(n=8)①單純?nèi)毖獙φ战M;②遠程缺血預(yù)處理組;③遠程缺血預(yù)處理+AM251組。缺血再灌注后3h,及24h,組織灌注,并截取腰段脊髓組織(L4～L6),每個時間點動物數(shù)量為4只,制作冰凍切片。行免疫組織化學(xué)染色觀察脊髓前角泛素的表達及TUNEL染色。免疫組化切片利用image pro plus 6.0軟件計算平均光密度值,分析結(jié)果。結(jié)果1.泛素在脊髓前角的表達:免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示,泛素在脊髓前角的神經(jīng)元內(nèi)有表達,染色陽性信號為淡蘭色顆粒,每張切片隨機選擇10個點計算其平均光密度值,遠程缺血預(yù)處理組3小時的泛素表達明顯低于對照組(P0.001),和遠程缺血預(yù)處理+AM251組(P0.01);再灌注24h后,遠程缺血預(yù)處理組泛素表達明顯低于對照組(P0.01),和遠程缺血預(yù)處理+AM251組(P0.01)。2.細胞凋亡實驗:在缺血再灌注后3h(早期),各組均未見凋亡細胞。結(jié)論遠程缺血預(yù)處理可以抑制脊髓缺血后早期的泛素表達,其原因與遠程缺血預(yù)處理誘導(dǎo)內(nèi)源性大麻素釋放,減輕脊髓損傷有關(guān)。脊髓缺血后泛素的表達明顯早于細胞凋亡發(fā)生的時間。 小結(jié) 1.短暫下肢遠程缺血預(yù)處理可以誘導(dǎo)大鼠脊髓的缺血耐受。 2.內(nèi)源性大麻素CB1受體介導(dǎo)了遠程缺血預(yù)處理誘導(dǎo)的脊髓缺血耐受。 3.遠程缺血預(yù)處理可以誘導(dǎo)脊髓節(jié)段內(nèi)內(nèi)源性大麻素AEA在脊髓缺血前釋放增加,通過CB1受體,調(diào)節(jié)脊髓局部血流,起到了脊髓保護作用。 4.遠程缺血預(yù)處理可以抑制脊髓缺血后早期的泛素表達,其原因與遠程缺血預(yù)處理誘導(dǎo)內(nèi)源性大麻素釋放,減輕脊髓損傷有關(guān)。脊髓缺血后泛素的表達明顯早于細胞凋亡發(fā)生的時間,結(jié)果提示泛素可能是脊髓損傷的一個早期標(biāo)志。
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【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2009
【分類號】：R363

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前3條

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本文編號：2439489