【摘要】： Foxp3是FOX(forkhead box)家族轉(zhuǎn)錄因子中的一員,是調(diào)節(jié)性T細胞(regulatory T cells,Treg)的特異性標志,同時在Treg的發(fā)生、發(fā)育、功能的維持與發(fā)揮方面起著關(guān)鍵作用。研究發(fā)現(xiàn)表達外源性Foxp3可使非Treg細胞具有類似Treg細胞樣的表型及免疫抑制功能。 人類免疫缺陷病毒1型(human immunodeficiency virus type 1,HIV-1)基因編碼的反式激活蛋白(Trans-activator transcription,TAT)中的蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域(protein transduction domain,PTD)能夠高效、快速地攜帶外源性蛋白穿入幾乎所有的真核細胞,而進入細胞漿。由于其具有核定位信號,因此也能進入細胞核內(nèi)。同時PTD具有不影響其攜帶的目的蛋白功能的特點。 目的:我們的研究是要利用生物大分子載體工具蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域(PTD)將Foxp3蛋白帶到細胞內(nèi),以獲取大量的免疫抑制細胞,從而突破Treg制約基礎(chǔ)和臨床器官移植的研究瓶頸,為最終應(yīng)用于器官移植和自身免疫性疾病治療奠定基礎(chǔ)。 方法:流式細胞術(shù)檢測PTD融合蛋白穿過細胞膜進入EL-4細胞中的能力和量效關(guān)系;Western Blot分析和激光共聚焦顯微鏡觀察確認融合蛋白進入細胞漿和細胞核;采用CCK-8法檢測融合蛋白對DO11.10鼠的CD4~+CD25~- T細胞活化增殖的影響,以及蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)的CD4~+CD25~- T細胞對效應(yīng)細胞的增殖抑制能力;RT-PCR檢測IL-2、INF-γ、IL-10、TGF-β和CTLA-4的mRNA表達水平;EHSA測定上清中IL-2、INF-γ、IL-10和TGF-β的分泌水平。 結(jié)果:通過流式細胞術(shù)分析證實表達的PTD-eGFP-Foxp3融合蛋白能高效的轉(zhuǎn)入細胞內(nèi);經(jīng)Western Blot和激光共聚焦顯微鏡觀察確認PTD-Foxp3和PTD-eGFP-Foxp3融合蛋白能夠進入細胞漿和細胞核;同時經(jīng)細胞增殖抑制實驗證明PTD-Foxp3融合蛋白能明顯抑制OVA特異性TCR轉(zhuǎn)基因小鼠DO11.10小鼠來源的CD4~+CD25~- T細胞的活化增殖能力,并且PTD-Foxp3轉(zhuǎn)導(dǎo)的DO11.10小鼠CD4~+CD25~- T細胞也有抑制細胞活化的能力;RT-PCR和ELISA結(jié)果可以看出PTD-Foxp3與Foxp3、PTD-eGFP相比可以明顯的抑制效應(yīng)細胞分泌的IL-2、IFN-γ,并促進抑制性因子IL-10的產(chǎn)生;RT-PCR檢測PTD-Foxp3轉(zhuǎn)導(dǎo)的D011.10小鼠CD4~+CD25~- T細胞,證實表面標志分子CTLA-4的表達有所升高。 結(jié)論:PTD-Foxp3具有調(diào)節(jié)CD4~+CD25~- T細胞的作用,并且有可能將CD4~+CD25~- T細胞轉(zhuǎn)化為Treg樣細胞,希望能應(yīng)用于自身免疫性疾病和抗器官移植排斥反應(yīng)的治療中。
[Abstract]:Foxp3 is a member of the FOX (forkhead box) family of transcription factors and a specific marker of regulatory T cell (regulatory T cells,Treg. At the same time, it plays a key role in the occurrence, development, maintenance and play of Treg. It was found that the expression of exogenous Foxp3 could induce Treg-like phenotype and immunosuppressive function in non-Treg cells. The protein transduction domain (protein transduction domain,PTD in transactivator protein (Trans-activator transcription,TAT) encoded by human immunodeficiency virus type 1 (human immunodeficiency virus type-1, HIV-1) gene is highly efficient. It quickly carries exogenous proteins through almost all eukaryotes and into the cytoplasm. Because of its nuclear localization signal, it can also enter the nucleus. At the same time, PTD has the characteristics of not affecting the function of the target protein it carries. Objective: our research is to use the biological macromolecule vector tool protein transduction domain (PTD) to carry the Foxp3 protein into the cell, in order to obtain a large number of immunosuppressive cells, so as to break through the bottleneck of Treg restriction foundation and clinical organ transplantation research. It lays a foundation for the final application in organ transplantation and autoimmune disease treatment. Methods: flow cytometry was used to detect the ability and dose-effect relationship of PTD fusion protein entering into EL-4 cells.; Western Blot analysis and laser confocal microscopy showed that the fusion protein entered into cytoplasm and nucleus. The effect of fusion protein on the activation and proliferation of CD4~ CD25~- T cells in DO11.10 mice and the inhibitory effect of CD4~ CD25~- T cells on the proliferation of effector cells were detected by CCK-8 assay. The mRNA expression of IL-2,INF- 緯, IL-10,TGF- 尾 and CTLA-4 was detected by RT-PCR, and the secretion of IL-2,INF- 緯, IL-10 and TGF- 尾 in supernatant was measured by EHSA. Results: the expressed PTD-eGFP-Foxp3 fusion protein could be efficiently transferred into the cell by flow cytometry, and the PTD-Foxp3 and PTD-eGFP-Foxp3 fusion protein could enter the cytoplasm and nucleus by Western Blot and laser confocal microscopy. The results of cell proliferation inhibition assay showed that PTD-Foxp3 fusion protein could significantly inhibit the activation and proliferation of CD4~ CD25~- T cells derived from OVA-specific TCR transgenic mice DO11.10 mice. In addition, CD4~ CD25~- T cells of DO11.10 mice transfected with PTD-Foxp3 also had the ability to inhibit the activation of cells. The results of RT-PCR and ELISA showed that compared with Foxp3,PTD-eGFP, PTD-Foxp3 could significantly inhibit the secretion of IL-2,IFN- 緯 by effector cells and promote the production of inhibitory factor IL-10. The expression of surface marker molecule CTLA-4 was detected by RT-PCR in D011.10 CD4~ CD25~- T cells transfected with PTD-Foxp3. Conclusion: PTD-Foxp3 can regulate CD4~ CD25~- T cells, and may transform CD4~ CD25~- T cells into Treg-like cells. It is hoped that CD4~ CD25~- T cells can be used in the treatment of autoimmune diseases and anti-organ transplantation rejection.
【學(xué)位授予單位】：江蘇大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號】：R341

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