【摘要】： 研究背景 細胞是機體最基本的結構和功能單位,在機體代謝過程中相互協調,其中細胞凋亡(apoptosis)對于調節(jié)組織發(fā)育和內穩(wěn)態(tài)有重要作用。細胞凋亡是細胞死亡的一種形式,一種基本的生命現象,參與機體的生長發(fā)育及衰老等多種生理過程,同時也是參與包括腫瘤在內的多種疾病的發(fā)病機制的重要因素。細胞凋亡信號轉導及分子調控機制一直是生命科學研究領域包括腫瘤在內的許多疾病發(fā)生發(fā)展過程中的一個非常重要的基本問題。雖然目前凋亡信號轉導的主要途徑已經明確,溶酶體是介導細胞凋亡的重要結構,且在不同誘導因素引發(fā)凋亡時,其凋亡信號轉導的途徑存在差異,但在多種誘因下溶酶體與線粒體之間凋亡信號轉導的具體機制尚未明確。 本實驗是在前期研究的基礎上進行的,既往我們發(fā)現氨基葡萄糖硫酸鹽(Glucosamine Sulfate,GS)可以誘導K562細胞凋亡,并且這種凋亡是通過溶酶體途徑釋放Cathepsin D( Cat D)介導的,而且與Bcl-XL的下調相關聯,但是Cat D信號是如何從溶酶體轉移到線粒體,與線粒體表面上的凋亡抑制蛋白Bcl-XL又有何種關系還不得而知。為明確在細胞凋亡中溶酶體釋放Cat D與線粒體外膜Bcl-XL有無相互作用的基礎,Bcl-XL是否為溶酶體Cat D與線粒體間凋亡信號轉導新路徑的下游底物分子,我們進行了它們的作用機制研究。 目的 建立氨基葡萄糖硫酸鹽(Glucosamine Sulfate,GS)誘導慢性髓性白血病(Chronic Myeloid Leukemia,CML) K562細胞凋亡的模型,用含5.0 mmol.L-1GS誘導K562細胞,應用免疫熒光、Western Blot、RNA干擾等方法檢測溶酶體釋放的Cat D與線粒體外膜上Bcl-XL的變化,探討在K562細胞凋亡模型中,Cat D與Bcl-XL作用機制。 方法 1.慢性髓性白血病K562細胞凋亡前后,MTT法檢測細胞凋亡前后的細胞活性;凋亡前后K562細胞HE染色、Hoechst33342檢測細胞形態(tài)變化;應用DNA ladder檢測細胞的凋亡情況;應用流式細胞儀檢測誘導后細胞狀態(tài)。 2.應用激光共聚焦顯微鏡觀察免疫熒光雙標記、Western blot方法檢測凋亡前后及應用Pepstatin A抑制Cat D前后細胞內的Cat D與Bcl-XL的相互作用機制。 3.購買的SANTA公司的特異性Cat D和Bcl-XL的小干擾RNA及陰性RNA。通過陽離子脂質體將siRNAs分別轉染K562細胞,倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)、免疫熒光雙標染色后的激光共聚焦成像、反轉錄PCR檢測轉染后再用GS處理前后48h后Cat D和Bcl-XL mRNA表達;利用免疫印跡技術測定細胞轉染siRNAs后,GS處理前后的Cat D和Bcl-XL的蛋白質表達情況; 結果 1.0.5 mmol.L-1、1.0 mmol.L-1、5.0 mmol.L-1的GS誘導均有細胞抑制作用,5.0 mmol.L-1的GS抑制性最強。HE染色對照組K562細胞呈圓形,邊界光滑,胞膜無皺縮,而5.0 mmol.L-1 GS處理72 h后,細胞皺縮,胞膜不光滑,出現空泡現象并且細胞有出芽現象。5.0 mmol.L-1 GS處理72 h后Hoechst33342染色顯示出凋亡細胞存在。5.0 mmol.L-1 GS處理72 h后DNA ladder的電泳圖片上出現180-200bp明顯條帶;在流式細胞儀檢測中對照的K562細胞,也有少許凋亡,為腫瘤細胞的自發(fā)凋亡,而經過5.0 mmol.L-1 GS誘導72 h后的K562細胞,凋亡明顯增多。與未處理的K562細胞相比5.0 mmol.L -1 GS誘導72 h后凋亡率由3.8 %變成12.4 % ,P0.05,。 2.經過5.0 mmol.L-1 GS誘導72 h后的K562細胞,Cat D與Bcl-XL的激光共聚焦信號明顯增強,Cathepsin D蛋白表達增加,而Bcl-XL蛋白表達減少。K562細胞經用Pepstatin A處理,再用5.0 mmol.L-1 GS誘導72 h較GS處理組的Cat D的表達減弱,Cat D與Bcl-XL的共定位信號較處理前的信號明顯增強,Cat D蛋白表達減少,而Bcl-XL蛋白表達則沒表現出明顯差異。 3.脂質體轉染干擾RNA后免疫熒光雙標的激光共聚焦顯示:分別轉染Cat D siRNA和Bcl-XL siRNA組的K562細胞,被轉染抑制的信號在共定位的信號中明顯減弱。5.0 mmol.L-1 GS誘導72 h分別轉染Cat D siRNA和Bcl-XL siRNA組中,Cat D與Bcl-XL的共定位信號CatD相對增強。與轉染的K562細胞相比,GS誘導凋亡前后Cat D蛋白表達增加而Bcl-XL蛋白表達未見明顯差異。 結論 1.成功構建氨基葡萄糖硫酸鹽誘導慢性髓性白血病的凋亡模型。5 mmol.L-1的GS誘導的K562細胞凋亡作用明顯; 2.5 mmol.L-1的GS誘導的凋亡細胞Cat D與Bcl-XL的共定位信號明顯增強。而Cat D蛋白表達增加,Bcl-XL蛋白表達減少。在Pepstatin A抑制Cat D后,再用5 mmol.L-1的GS誘導與單純的5 mmol.L-1的GS誘導的K562細胞,可以看出在Pepstatin A抑制后,Cat D與Bcl-XL的共定位信號中顯現Cat D的信號增強。Cat D蛋白表達減少,而Bcl-XL蛋白表達則沒表現出明顯差異。 3.脂質體轉染干擾RNA Cat D與Bcl-XL后兩者的共定位信號減弱。干擾Cat D后,Cat D與Bcl-XL的共定位信號表現為Cat D的表達減弱而Bcl-XL相對增強;干擾Bcl-XL后,Cat D的表達相對增強。干擾Cat D與Bcl-XL前后兩者的蛋白表達均受抑制,而在5 mmol.L-1的GS誘導后,Cat D的表達增強,而Bcl-XL則沒有明顯變化。
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【學位授予單位】：第四軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2010
【分類號】：R363

【參考文獻】

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本文編號：2431064